《Food Research International》：Biofilm-inspired encapsulation enhances the viability of probiotic
Lacticaseibacillus paracasei NN4–1 under simulated gastrointestinal conditions
Fedrick C. Mgomi|Chunlei Lu|Anqi Tang|Shu Xu|Fei Chen|Lei Yuan|Zhen-quan Yang
江苏扬州大学食品科学与工程学院，中国扬州225127
摘要
益生菌在通过胃肠道（GIT）时的存活仍然是一个重大挑战，这限制了它们在体内的功能效果。微生物通常通过形成生物膜来抵抗不利条件。利用这一特性，本研究介绍了一种新型的生物膜启发式封装方法，使用单层和多层涂层的海藻酸盐凝胶珠（SAGBs）来促进乳酸菌Paracasei NN4–1在体内的生物膜形成。通过比较分析，在模拟的GIT条件下评估了SAGBs、浮游细胞和生物膜细胞的存活能力。体外研究表明，SAGBs的存活率提高了81.48%，而未封装的细胞存活率较低。此外，生物膜封装增加了生化产物的产生，蛋白质和多糖的平均浓度分别为0.633 mg/mL和1.056 mg/mL。扫描电子显微镜显示SAGBs内部有细菌群集。全基因组测序揭示了与生物膜形成、耐受性、粘附性以及抗酸性和抗胆盐性相关的多个基因。多层SAGBs减少了52.52%的细菌泄漏，减缓了小分子的扩散，并略微改善了质地特性，同时没有影响细菌的代谢活性或生长。此外，在牛奶中冷藏21天后，SAGBs的存活率（99.43%）明显高于浮游细胞（76.3%）和生物膜细胞（77.5%）。这种方法为设计下一代功能性食品和靶向益生菌递送系统提供了有希望的应用前景，有助于在GIT的不利条件下提高益生菌的存活率。
引言
益生菌的健康促进潜力使其被广泛应用于功能性食品、营养保健品和治疗配方中。为了使益生菌能够充分发挥其功能，它们必须在加工、储存和传输到胃肠道（GIT）的过程中保持其活性（Mgomi等人，2025年）。特别是，胃肠道对益生菌的存活和功能构成了重大挑战，因为胃液中的酸性环境和小肠中的高浓度胆盐会降低口服益生菌的活性，从而限制其在体内的效果。例如，暴露于高浓度胆盐会破坏细菌细胞膜，导致蛋白质变性或错误折叠，可能还会导致核酸损伤、pH值失衡以及渗透压和氧化应激（Lv等人，2017年）。
为了解决这些挑战，已经开发了多种保护策略来提高益生菌的韧性，包括使用冷冻保护剂（Nguyen等人，2022年）、益生元共配制（Thinkohkaew等人，2025年）和封装技术（Yuan等人，2023年）。同时，最近的研究表明，食品衍生的基质和农业工业副产品可以作为益生菌的基质和递送载体，提供益生元成分，提高加工过程中的存活率，并增强发酵产品的功能。例如，腰果副产品已成功应用于益生菌发酵乳中，改善了发酵性能并调节了功能性特性（Herkenhoff等人，2023年；Herkenhoff等人，2024年），而红火龙果果肉则被提议作为益生菌的植物基基质，影响生物活性化合物的稳定性和感官特性（Suzuki等人，2024年）。
尽管如此，微胶囊化已成为一种有前景的方法，它提供了对抗环境压力的物理屏障，同时实现可控释放和靶向递送（Liu等人，2023年；Mgomi等人，2024年；Xu等人，2022年）。然而，封装的成功在很大程度上取决于封装基质的结构完整性和对益生菌所承受的动态和自然压力环境的模拟能力。多项研究已经认识到使用传统封装系统（包括基于海藻酸盐、壳聚糖、淀粉、乳清蛋白或其组合的系统）的潜在优势（Razavi等人，2021年；Xu等人，2022年；Ying等人，2010年）。然而，这些方法在有效保持益生菌活性方面往往存在局限性。这些局限性主要归因于机械强度不足、孔结构不规则、胃酸扩散不受控制以及对消化酶的抵抗力有限（Zhang等人，2022年）。此外，许多封装基质缺乏天然微生物防御系统所具有的适应性和多功能性。
与传统的浮游细胞基方法相比，一种新型的生物膜启发式封装技术（NBET）最近被提出，通过利用益生菌的天然生物膜形成能力与封装材料相结合来提高益生菌的活性（Mgomi、Yuan、Farooq、Lu和Yang，2024年；Mgomi、Zhang、Lu、Yang和Yuan，2025年；Yuan等人，2023年）。与通常具有不良影响的病原体生物膜不同，新兴证据表明，益生菌衍生的生物膜具有一系列有益功能，包括在发酵过程中增强和调节微生物代谢（Yao等人，2022年）、表现出抗菌活性（Mgomi等人，2023年），以及作为益生菌有效递送的保护基质（Gao等人，2025年）。
此外，益生菌生物膜为封装提供了有吸引力的生物学模型，因为它们已知能够产生一种细胞外聚合物物质（EPS）基质，这种基质可以提供对极端pH值、氧化应激和抗菌剂的卓越保护，同时促进微生物群落的韧性和代谢协调（Kubota等人，2008年）。例如，受细胞介导的保护机制启发，最近的一项研究引入了一种使用钙海藻酸盐凝胶珠的固体和液体核心的体内再培养方法，以促进生物膜的形成。这种方法显著提高了Lactobacillus rhamnosus GG在体外胃酸（pH 2）和胆盐（0.6%）压力下的存活率，生物膜封装细胞在胃酸中2小时后的存活率为100%，对胆盐的抵抗率为59.38%–92.39%（Yuan等人，2023年）。同样，高密度的Lactobacillus paraplantarum L-ZS9生物膜在钙果胶珠（CPB）内成功形成，形成了CPB-生物膜-体内结构。同样，CPB-生物膜-体内结构在37°C下2小时内对各种pH值（1.5至4）表现出高抵抗力（Liu等人，2023年）。
尽管该领域受到越来越多的关注，但科学数据的稀缺仍然推动了研究兴趣。生物膜启发式封装技术仍处于早期发展阶段，需要进一步的研究来探索和验证其在益生菌递送中的潜在应用。此外，关于封装条件下益生菌生物膜形成能力的研究仍然有限。因此，据我们所知，这是第一项展示在多层海藻酸盐凝胶珠（SAGBs）基质内Lactaseibacillus paracasei NN4–1生物膜样结构的体内形成的研究，并且首次描述了使用天然海藻酸盐聚合物（海藻酸钠，SoA）与Ca2+交联在SAGBs上进行多层制造的可能机制（图1）。
此外，使用结晶紫（CV）染色评估了L. paracasei NN4–1的生物膜形成能力，同时使用扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）表征了其结构特性。此外，还使用SEM、质地分析（TPA）和扩散渗透性测定分析了多层SAGBs的物理化学特性。此外，进行了基因组测序，以全面了解与其特征行为相关的重要基因的分子谱型。因此，这些发现表明NBET是一种有前景的下一代策略，可以增强益生菌的活性，延长保质期，并为开发稳定的益生菌递送系统提供有价值的见解。
细菌生长条件
L. paracasei
NN4–1菌株是从中国扬州高邮奶牛场收集的牛奶中分离出来的，通过16s rRNA基因测序鉴定并确认，序列同一性为99.72%。该菌株保存在含有25%（v/v）甘醇的De Mann, Rogosa, Sharpe（MRS）肉汤中（青岛Hope生物有限公司，青岛，中国）。实验前，该菌株在37°C的MRS肉汤中进行了三次传代培养。
L. paracasei
NN4–1的生物膜形成能力
使用CV染色、SEM和CLSM评估了L. paracasei
NN4–1在24小时内的生物膜形成能力。定量CV染色显示生物膜生物量随时间增加，吸光度从8小时时的0.637上升到16小时时的1.024，24小时时达到1.574（图2A）。同时，SEM成像支持了这些发现，显示24小时后表面有高细胞密度和广泛的细胞外基质覆盖。生物膜表现出不规则的架构
结论
当前的研究强调了NBET在提高益生菌在传输到胃肠道过程中的活性和功能效果方面的潜力。本研究展示了在多层SAGBs中对L. paracasei
NN4–1进行体内封装后成功的生物膜形成。结果表明，这些珠子在胃肠道条件下表现出很强的韧性，并且在细菌定植后改善了流变特性。
CRediT作者贡献声明
Fedrick C. Mgomi：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，调查，概念化。
Chunlei Lu：撰写 – 审稿与编辑，方法学。撰写 – 审稿与编辑，方法学。
Shu Xu：撰写 – 审稿与编辑，可视化。
Fei Chen：撰写 – 审稿与编辑，可视化，方法学。
Lei Yuan：撰写 – 审稿与编辑，可视化，监督，调查，概念化。
Zhen-quan Yang：撰写 – 审稿与编辑，监督，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到了
国家自然科学基金（Grant No. 32372368，No. 32302953），
江苏省重点研发计划（BE2019436-5），
江苏省自然科学基金（BK20210814），
中国博士后科学基金（2021TQ0274，2022M720120），
扬州大学“青兰”人才支持计划，以及江苏农业集团有限公司南通分公司的餐饮食品联合发展基金的支持。
