通过转录组分析探讨氮和磷限制对提高Schizochytrium sp.产DHA（二十二碳六烯酸）产量的影响机制

《Food Research International》：Transcriptomic analysis of the mechanism of nitrogen and phosphorus limitation on improving the yield of DHA by Schizochytrium sp.

DHA合成微生物Schizochytrium sp.通过氮磷限制（NPL）调控代谢通量、NADPH供需及ROS水平，实现DHA产量提升18.9%和11.7%。转录组学揭示NPL促进中央碳代谢（HK、PK）、乙酰辅酶A合成（PDHA、PDHB、DLAT、acs）及脂肪酸合成（ACC、VAS2）关键基因表达，早期ME活性增强积累饱和脂肪酸，中期G6PDH活性提升保障NADPH供应，晚期ROS应激进一步刺激DHA合成。脂质组成发生膜重组构，中性脂占比下降，甘油脂和磷脂占比上升。

　　

乔坤|孟超凡|黄媛静|彭邦柱

华中农业大学食品科学与技术学院，武汉430070，中国

摘要

二十二碳六烯酸（DHA）是一种重要的ω-3多不饱和脂肪酸，具有显著的营养和健康价值，人们越来越希望从可持续的微生物来源中获取它。为了提高其生物产量，本研究通过综合生理学和转录组学分析，探讨了氮磷限制（NPL）如何促进Schizochytrium属菌株中的DHA生物合成。结果表明，NPL使总脂质和DHA的产量分别增加了18.9%和11.7%。转录组分析显示，NPL促进了向脂质生物合成方向的营养流，这体现在参与中心碳代谢（HK, PK）、乙酰辅酶A生成（PDHA, PDHB, DLAT, acs）和脂肪酸生物合成（ACC, FAS2）的关键基因显著上调。在发酵早期（24小时），苹果酸酶（ME）活性的升高促进了饱和脂肪酸（SFA）的积累，尤其是棕榈酸（C16:0）。同时，NPL抑制了过氧化物酶体的β-氧化，从而减少了DHA的降解。到发酵中期（72小时），尽管转录水平没有变化，但葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的活性显著增加，提高了NADPH的可用性，促进了DHA的合成。在发酵后期（120小时），NPL显著增加了细胞内的活性氧（ROS）水平，进一步促进了DHA的积累。总体而言，NPL改变了Schizochytrium属菌株中的中心碳代谢、NADPH分配和氧化还原平衡。这种协调的调控机制包括由ME产生的NADPH驱动早期的SFA积累，而由戊糖磷酸途径（PPP）产生的NADPH在ROS的刺激下促进了后期的DHA富集。这些发现证实了在NPL条件下脂质和DHA产量的增加，并强调了其在生物技术应用中的巨大潜力。

引言

二十二碳六烯酸（DHA）是一种ω-3长链多不饱和脂肪酸，是人类神经组织（包括大脑和视网膜）的关键结构成分（Jiang等人，2024年）。它的营养益处包括促进婴儿认知发展（Liu等人，2023年）以及缓解动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和银屑病等慢性疾病（Bercea等人，2021年；Rahim等人，2022年）。然而，由于其主要来源——海洋鱼油的可持续性因过度捕捞和生态压力而日益受到威胁（Dedman等人，2022年）。值得注意的是，鱼类并不自身合成DHA，而是通过海洋食物网从微生物生产者那里获取（Huaqiu等人，2025年），这突显了直接微生物发酵作为一种可扩展且可持续的替代方案的潜力（Bi等人，2023年）。在油性微生物中，Schizochytrium因其高DHA含量、快速生长周期、适合人工培养、对人体安全的特性以及易于操作的脂质生物合成途径而受到广泛关注，使其成为一种可持续的DHA来源（Ramos-Vega等人，2018年；Wang等人，2021年）。尽管有这些优势，但在传统发酵条件下，工业规模的生产仍受到DHA产量不足的阻碍。

营养限制已被广泛用于刺激油性微生物的脂质过度生产（Chen等人，2024年；Maltsev等人，2023年；Mao等人，2024年；Wang, Bi等人，2019年）。例如，氮限制不仅提高了微藻中的总脂质含量（Maltsev等人，2021年），还特别促进了高价值化合物的积累。在Schizochytrium属菌株中，与对照组相比，DHA产量增加了58.1%（Jia等人，2024年）。类似地，磷限制显著影响了脂质代谢，使Chloroidium ellipsoideum和Chlorococcum infusionum的总脂质含量分别增加了两倍和三倍（Satpati等人，2016年）。这种方法还可以显著缩短发酵周期；在Schizochytrium HX-308中，磷限制将发酵时间从56小时缩短至44小时，并将DHA产量提高到291毫克/升/小时，比磷酸充足条件下的产量高出1.42倍（Sun等人，2014年）。最近的研究从单一营养限制转向了多营养素协同调控，氮磷（N:P）比例成为关键的代谢调节因素。通过重新定向中心碳代谢流，它实现了Chlorella和Xanthophyllomyces等微生物中生物量与脂质产量之间的最佳平衡，并允许精确调控脂肪酸组成（Mao等人，2023年；Rasdi & Qin，2015年）。

尽管有这些生理学发现，但在氮磷限制（NPL）条件下控制DHA生物合成的分子机制和动态调控网络仍不完全清楚。大多数先前的研究仅关注了最终的生理变化或孤立的代谢步骤，缺乏对NPL引起的转录重编程和代谢流重新分配的全面和时间分辨的视角。关键未解决的问题包括碳在饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸合成之间的分配、NADPH供应的阶段特异性调控，以及氧化还原平衡（特别是活性氧（ROS）在调节DHA积累中的作用。尽管多组学方法现在能够系统地解析应激反应代谢（Chenna & Wei，2024年；Dorey & Howorka，2024年；More等人，2017年；Whalen等人，2022年），但在NPL条件下对Schizochytrium属菌株进行的时间序列转录组分析仍然很少。

为了解决这些空白，本研究首先评估了氮和磷补充对Schizochytrium属菌株在整个发酵过程中的影响。随后，建立了一个对照组（CK）和一个优化后的营养限制组（NP），以研究DHA生物合成的动态，包括整个发酵过程中营养消耗、脂质积累和脂肪酸组成的变化。然后进行了转录组分析，以识别在NPL条件下与碳代谢、脂肪酸和甘油三酯生物合成以及过氧化物酶体功能相关的差异表达基因。测定了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）和苹果酸酶（ME）的酶活性，以阐明阶段特异性的NADPH供应机制。最后，进行了过氧化氢（H?O?）诱导的氧化应激模拟，以探究ROS介导的调控在DHA生物合成中的作用。

部分摘录

微生物和培养条件

Schizochytrium D1.0（CCTCCM 2016617）由中国典型培养物中心提供，储存在50%（v/v）甘油中，温度为?80 °C。发酵培养基（g/L）包含葡萄糖140.00、酵母10.00、玉米浆5.00、VB₁ 0.001、VB₆ 0.01、VB₁₂ 0.02、硫酸镁0.50、硫酸钠3.00、硝酸钠3、硫酸铜0.16和硫酸钾0.87，pH值为5。其中，有机氮源由酵母提取物和玉米浸出液混合物（2:1比例）组成。

氮和磷添加对Schizochytrium属菌株发酵中DHA合成的影响

如图1所示，氮和磷的水平显著影响了Schizochytrium属菌株的发酵性能。生物量（图1A）随着氮浓度的增加而增加，直到25克/升，但在35克/升时下降。相比之下，脂质产量（图1B）在整个氮浓度范围内逐渐减少。DHA产量（图1C）在氮浓度为15克/升时达到峰值。细胞内脂质含量（图1D）随着氮浓度的升高从67.88%下降到48.17%。

讨论

NPL通过重新定向代谢流和重新编程调控网络，显著重构了Schizochytrium属菌株的DHA发酵代谢。统计分析显示，培养基氮浓度与脂质产量和细胞内脂质含量之间存在显著的负相关（r = ?0.893和?0.899，P < 0.01）。相反，DHA与总脂肪酸的比例之间存在强正相关（r = 0.949，P < 0.01）。相反，磷浓度

结论

在NPL条件下，Schizochytrium属菌株的总脂质和DHA产量分别增加了18.93%和11.72%。细胞内脂质含量增加了12.82%，而蛋白质和碳水化合物含量分别减少了4.50%和1.41%。脂质组成发生了显著变化：中性脂质减少（从83.67%降至73.49%），而糖脂和磷脂增加（分别增加到18.96%和7.55%），表明在营养压力下发生了膜重构。

CRediT作者贡献声明

乔坤：撰写——初稿、方法学、正式分析、数据管理、概念构思。孟超凡：撰写——初稿、方法学、正式分析、数据管理、概念构思。黄媛静：监督、方法学、概念构思。彭邦柱：撰写——审稿与编辑、资源管理、项目管理、资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了华中农业大学-AGIS合作基金（SZJY2022021）和宁夏回族自治区重点研发计划（2023BCF01025）的资助。