《Future Foods》：Impact of soybeans maturation stage on the discovery of dipeptidyl peptidase-4 and pancreatic α-amylase inhibitory peptides from soybeans
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为探索天然抗糖尿病药物来源，研究人员聚焦大豆蛋白水解物，深入研究了种子成熟阶段（绿荚期R6 vs. 完熟期R8）对不同酶（Alcalase、Bromelain、Flavourzyme）水解产物抑制α-淀粉酶(AA)和二肽基肽酶IV(DPP-4)活性的影响。研究发现Flavourzyme水解物抑制活性最佳，并通过LC-MS/MS、分子对接及模拟胃肠消化等技术，从绿大豆和成熟大豆水解物中分别鉴定出18和25条生物活性肽，其中肽段SFFFPFELPRE对两种酶均显示出显著抑制潜力。该研究为开发基于大豆成熟度的靶向性抗糖尿病功能食品提供了新思路。
在全球范围内，2型糖尿病（T2DM）的发病率持续攀升，已成为严峻的公共卫生挑战。当前，抑制体内关键代谢酶是控制餐后血糖的有效策略之一，其中，胰α-淀粉酶（AA）负责分解淀粉，而二肽基肽酶IV（DPP-4）则会降解具有降糖作用的肠促胰岛素。市面上虽有相应的合成酶抑制剂，但往往伴随着副作用和高昂的成本。因此，从天然食物中寻找安全、高效的酶抑制剂，成为极具前景的研究方向。植物性食品，特别是大豆，因其丰富的蛋白质和已证实的健康益处，成为发掘功能性生物活性肽的理想“矿藏”。然而，一个有趣的问题随之浮现：同一种作物，在其生命周期的不同阶段（例如尚处豆荚的绿大豆与完全成熟的黄大豆），其蛋白质组成和结构可能存在差异，这是否会影响由其衍生出的生物活性肽的功效？这个问题此前鲜有系统探究。为了填补这一空白，一项发表在《Future Foods》上的研究就此展开，旨在揭示大豆成熟阶段如何影响其蛋白水解物对AA和DPP-4的抑制能力，并从中鉴定出关键的活性肽段。
为了回答上述问题，研究人员设计了一套组合研究方法。首先，他们分别从市售的绿大豆（R6期）和成熟大豆（R8期）中分离出蛋白质。接着，利用三种不同的蛋白酶（Alcalase、Bromelain、Flavourzyme）在50°C下对这两种蛋白进行为期2、4、6小时的水解，制备出一系列蛋白水解物。研究通过测定水解过程中游离氨基氮的增加来评估蛋白水解程度，并使用反向超高效液相色谱分析水解物的肽谱。核心的生物活性评估则通过体外酶学实验完成，分别测定了各水解物对AA和DPP-4的半数抑制浓度（IC50）。对于活性最高的水解物样本，研究人员采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行肽段鉴定与测序。随后，他们利用生物信息学工具（如PepSite 2、HPEPDOCK、CABS-dock）对鉴定出的肽段进行分子对接模拟，预测其与AA和DPP-4酶的相互作用模式和结合能。最后，通过在线服务器（如ToxinPred、ADMETlab、BIOPEP-UWM）对筛选出的关键肽段进行了理化性质、毒性、类药性以及模拟胃肠道消化稳定性的计算机模拟分析。
3.1. 绿大豆与成熟大豆蛋白质在不同蛋白酶作用下的水解程度
研究结果显示，蛋白水解程度具有酶种和成熟度特异性。对于绿大豆蛋白，Bromelain在6小时时显示出最高的水解效率；而对于成熟大豆蛋白，Alcalase的水解效率最高。这揭示了不同蛋白酶对处于不同成熟阶段的大豆蛋白底物具有不同的切割偏好性。
3.2. 绿大豆与成熟大豆酶解蛋白水解物的抑制特性表征
3.3.1. AA抑制活性
所有酶解产物的AA抑制活性均显著高于未水解的完整蛋白。在绿大豆水解物中，Flavourzyme酶解2小时的产物抑制活性最强（IC50= 26.57 μg/mL）；在成熟大豆水解物中，Flavourzyme酶解4小时的产物抑制活性最强（IC50= 36.79 μg/mL）。总体而言，绿大豆蛋白水解物表现出比成熟大豆蛋白水解物更强的AA抑制潜力。
3.3.2. DPP-4抑制活性
与AA抑制结果类似，酶解显著增强了水解物的DPP-4抑制活性。绿大豆蛋白水解物的活性提升尤为明显。其中，Flavourzyme处理绿大豆蛋白2小时得到的水解物活性最高（IC50= 29.26 μg/mL）。这表明绿大豆蛋白可能是生成强效DPP-4抑制肽的更好来源。
3.4. 从选择性GSPHs和MSPHs中鉴定具有强效生物AA和DPP-4抑制活性的肽段
研究人员从活性最高的几组水解物中，通过LC-MS/MS共鉴定出62条肽段，并基于生物活性评分筛选出43条（绿大豆来源18条，成熟大豆来源25条）进行深入分析。
3.4.1. 肽段序列及其与AA酶的分子结合机制
计算机模拟分析揭示了这些肽段与AA酶活性位点的结合潜力。例如，来自绿大豆Flavourzyme水解物的九肽CFAAPEGPL能够与AA的7个关键活性位点（包括Trp58、Trp59、Tyr62、Asp300等）结合。而来自成熟大豆Alcalase水解物的十三肽FAGVVPAPLCCAT则能结合多达15个位点。值得注意的是，肽段AIPVNKPGRF能够与AA的所有催化残基（Asp96、Asp197、Glu233、Asp300）结合，预示其具有强效抑制潜力。许多肽段富含脯氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等疏水性氨基酸，这有助于其与酶活性口袋的疏水区域相互作用。
3.4.2. GSPHs和MSPHs衍生肽段与DPP-4抑制酶的分子结合机制
分子对接显示，多数鉴定出的肽段能与DPP-4酶的关键活性位点（如催化三联体Ser630、Asp708、His740以及底物结合口袋S1、S2）结合。来自绿大豆Bromelain水解物的十一肽SFFFPFELPRE表现最为突出，能与12个关键残基相互作用。来自成熟大豆的肽段AIPVNKPGRF和FAGVVPAPLCCAT也显示出与DPP-4活性中心的紧密结合能力。
3.5. 通过计算机模拟评估所选肽段的结合、稳定性及类药性
进一步的分子动力学模拟表明，一些关键肽段（如SFFFPFELPRE、CFAAPEGPL）与AA或DPP-4形成的复合物在模拟时间内结构稳定，验证了对接结果的可靠性。类药性分析预测，除FAGVVPAPLCCAT外，其余关键肽段及其在模拟胃肠消化中产生的片段均无毒、水溶性良好，且符合类药五原则，具有较好的开发前景。
本研究系统阐明了大豆成熟阶段对其蛋白水解物抗糖尿病酶抑制活性的显著影响。总体而言，绿大豆蛋白水解物，特别是经Flavourzyme短时间处理后，在抑制AA和DPP-4方面表现出比成熟大豆蛋白水解物更优的潜力。这可能是由于不同成熟阶段大豆蛋白质的构象和基质可及性存在差异。通过先进的肽组学与计算机模拟技术，研究者成功从绿大豆和成熟大豆水解物中分别挖掘出18条和25条高活性肽段，并重点揭示了CFAAPEGPL、AIPVNKPGRF、SFFFPFELPRE和FAGVVPAPLCCAT这四条肽段通过与酶活性中心的关键残基（如AA的Trp58/Trp59/Asp300，DPP-4的Ser630/Tyr662）发生多点结合，从而发挥抑制作用的分子机制。其中，肽段SFFFPFELPRE对AA和DPP-4均表现出最强的结合亲和力，展示了其作为双靶点抑制剂的巨大潜力。此外，计算机模拟的胃肠消化稳定性和类药性评估为这些肽段的后续开发和口服利用提供了积极的理论支持。这项研究的发现具有多重重要意义：首先，它强调了作物收获时机（成熟度）可作为调控功能性食品成分生物活性的一个新维度，为农产品增值提供了新思路。其次，研究鉴定出的全新抗糖尿病肽序列，为设计新型降糖药物或膳食补充剂提供了宝贵的先导化合物。最后，该工作综合运用了体外酶学、肽组学和计算机模拟等多学科技术，为从天然食物资源中高效、理性地发掘生物活性肽建立了一套可借鉴的研究范式。
