《PLOS One》：Genetic ablation of interleukin-17A augments fibrosis in a mouse model of cholestatic liver injury
Abstract
Aim
导致胆汁淤积性肝损伤的潜在机制尚不清楚。促炎性白细胞限制性细胞因子白细胞介素-17A (IL-17A) 已被认为与人类胆汁淤积性肝损伤有关。然而，其机制尚不明确，需要在临床前模型中进一步探索。本研究旨在检测IL-17A基因缺失在胆汁淤积性肝损伤小鼠模型中的作用。
Method
将年龄和性别匹配的同窝野生型 (WT) 和 Il-17a-/-C57BL/6小鼠间歇性喂食0.1% 3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢可力丁 (DDC) 饮食21天以诱导胆汁淤积性肝损伤，或喂食对照饮食。
Results
与WT同窝小鼠相比，Il-17a-/-小鼠显示出更丰富的结蛋白阳性肌成纤维细胞和增加的纤维化。使用纤维化相关基因 panel 对肝内白细胞群体进行的NanoString分析发现，在喂食DDC的 Il-17a-/-小鼠中，Tnfsf14（编码蛋白LIGHT）表达上调。尽管质谱流式细胞术发现喂食DDC的两种基因型小鼠中髓系细胞均增加，但我们未能在该细胞谱系中检测到LIGHT表达。相反，通过流式细胞术评估，LIGHT表达的上调主要局限于CD4+T细胞群体。在Th1+CD4+T细胞群体中观察到LIGHT表达增强。LIGHT在体外激活了原代人肝星状细胞，表明LIGHT对肝纤维化的刺激可能是直接的。
Conclusion
综上所述，这些数据表明，在胆汁淤积小鼠模型中，IL-17A通过抑制Th1极化的CD4+T细胞表达促纤维化细胞因子LIGHT，从而限制肝纤维化；这一发现需要在其他模型中进一步验证。
Introduction
白细胞介素-17A (IL-17A) 不仅是多种免疫介导和炎症性疾病中炎症和组织损伤的核心介质，也是其中几种疾病成功的治疗靶点。近年来，IL-17A在多种肝脏疾病中的作用日益受到关注，研究表明其参与肝损伤和纤维化的发病机制，包括胆汁淤积性肝损伤。原发性硬化性胆管炎 (PSC) 是一种重要的免疫介导的人类胆汁淤积性肝病，治疗选择有限，其发病机制中涉及IL-17A。
IL-17A是IL-17家族中最主要的成员，与IL-17F具有结构相似性和重叠的生物学效应。然而，IL-17A已被证明在自身免疫中起主导作用，因此成为IL-17导向疗法的主要靶点。IL-17A主要由CD4+T辅助细胞 (Th17) 产生，但也由其他CD4+T细胞亚群和非CD4+T细胞产生。IL-17A通过与相应的受体家族 (IL-17RA和IL-17RC) 结合，通过激活下游信号通路（包括核因子κB (NF-κB) 和丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 通路）发挥其促炎作用。通过这些信号级联，IL-17A驱动促炎细胞因子、趋化因子、抗微生物肽 (AMP) 和基质金属蛋白酶 (MMP) 的产生，这些在宿主防御和组织修复中起关键作用。然而，在胆汁淤积性疾病中，这些相同的分子可能创造一个允许持续炎症、随后组织损伤和纤维化的环境。
然而，考虑到PSC与炎症性肠病 (IBD) 之间存在关联（约70%的PSC患者伴有IBD），需要谨慎看待IL-17A的有害作用。IL-17A导向疗法在IBD中被证明是不成功甚至有害的，因为IL-17A在维持肠上皮通透性和粘膜完整性方面起着至关重要的作用。此外，最近一项研究描述，通过上调胆管细胞上的程序性死亡配体1 (PD-L1)，IL-17在限制胆汁淤积性肝损伤中发挥了重要作用，通过保护免受CD8+T细胞介导的炎症性胆管损伤。这些数据表明IL-17A的功能作用因疾病背景而异。因此，本研究旨在评估IL-17A基因缺失对DDC喂养小鼠肝脏的影响，该模型模拟了慢性胆汁淤积性肝损伤的许多特征。
Materials and methods
Animal studies
所有动物实验均经过伦理审查，并根据梅奥诊所机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。使用C57BL/6野生型小鼠、Il-17a-/-小鼠和 Il-17af-/-小鼠。通过间歇性喂食含0.1% DDC的饮食或对照饮食21天诱导8-10周龄性别匹配的实验小鼠发生胆汁淤积性肝损伤。在第22天通过二氧化碳吸入法处死小鼠。
Serum biochemistry
通过离心分离血清，并使用Vetscan VS2分析丙氨酸转氨酶 (ALT)、碱性磷酸酶 (ALP)、胆汁酸 (BA)、总胆红素 (TBIL) 和胆固醇。
Histology
肝组织样本用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片后进行苏木精-伊红 (H&E) 染色和天狼星红染色评估纤维化。
Fluorescence Immunostaining
组织切片进行抗原修复后，与一抗孵育，再用荧光标记的二抗检测，DAPI复染细胞核。使用ImageJ软件进行数字图像分析。
Isolation of intrahepatic leukocytes (IHL)
通过Percoll密度梯度离心法从小鼠肝脏中分离肝内白细胞 (IHL)。
Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
从IHL或肝组织片段中提取总RNA，反转录成cDNA后，使用SYBR Green进行实时荧光定量PCR分析基因表达。
Multiplex Gene Expression Assay
使用NanoString nCounter Mouse Fibrosis V2 Panel对从IHL中提取的总RNA进行多重基因表达分析，检测760个纤维化相关基因的表达。
Time-of-flight Mass cytometry (CyTOF)
使用包含37种抗体的混合物对新鲜分离的IHL进行染色，通过质谱流式细胞术分析免疫细胞群体。
Flow cytometry
对IHL进行细胞表面和细胞内染色，通过流式细胞术分析不同免疫细胞群体及其LIGHT表达。
Primary human hepatic stellate cell culture
培养原代人肝星状细胞，并用重组人LIGHT刺激，通过qRT-PCR检测促纤维化基因的表达。
Statistical analysis
数据以均值±标准误表示，使用GraphPad Prism软件进行统计学分析，包括单因素方差分析、Tukey事后检验和Mann-Whitney检验。
Results
DDC diet-induced cholestatic injury and ductular reaction are comparable in WT and Il-17a-/-mice
小鼠喂食对照或DDC饮食21天。qRT-PCR证实 Il-17a-/-小鼠IHL中 Il-17a表达缺失，且 Il-17f表达无补偿性增加。DDC饮食喂养的WT和 Il-17a-/-小鼠体重减轻，肝体比增加，且两者无显著差异。两组小鼠的血清ALT、ALP、总胆汁酸、总胆红素和胆固醇水平也相似。
H&E染色显示，DDC喂养的WT和 Il-17a-/-小鼠门静脉周围炎症程度相似。通过细胞角蛋白19 (CK19) 和细胞角蛋白7 (CK7) 免疫染色评估胆管反应性 (DR) 细胞扩张，发现两种基因型小鼠在DDC饮食下CK19和CK7阳性区域均增加。这些数据表明，Il-17a的基因缺失并未改变DDC饮食诱导的胆汁淤积中胆管反应的程度。
Hepatic myofibroblasts are increased, and hepatic fibrosis is enhanced in the cholestatic Il-17a-/-mice
为确定 Il-17a缺失对肝纤维化的影响，对肝组织切片进行结蛋白 (desmin) 染色以检测肌成纤维细胞。与WT相比，DDC喂养的 Il-17a-/-小鼠总肌成纤维细胞丰度增加。作为肝纤维化的标志，天狼星红染色和COL1α1免疫染色分析显示，Il-17a-/-小鼠纤维化沉积增加。此外，在 Il-17af-/-小鼠的整个肝裂解物中，促纤维化基因 Tgfb, Timp1, Fn1, Acta2, Col1a1,和 Col4a显著上调。这些数据表明，Il-17a的缺失加剧了胆汁淤积性肝损伤中的门静脉纤维化。
DDC diet-induced cholestasis drives a transformation in the immune cell landscape of WT and Il-17a-/-mice
通过连续免疫染色可视化胆汁淤积WT小鼠肝脏的门静脉束，发现门管区胆管周围存在大量胶原沉积以及多种细胞类型。为了解免疫细胞如何导致突变小鼠中观察到的纤维化增强，使用质谱流式细胞术 (CyTOF) 评估WT和 Il-17a-/-小鼠的免疫细胞景观。t-SNE图显示CD45+IHL分为28个不同的簇，包括T细胞、B细胞、库普弗细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等。层次聚类分析表明，非胆汁淤积和胆汁淤积小鼠分为两个不同的组。在基础条件下，淋巴细胞 (B细胞和T细胞) 占主导地位，占免疫细胞的60%以上。然而，胆汁淤质导致髓系细胞流入，改变了免疫景观，中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞占主导地位。总B细胞在非胆汁淤积肝中约占IHL群体的49%，在胆汁淤积肝中降至约3%。 resident库普弗细胞在两种基因型胆汁淤积肝中均降至<1%。相反，浸润的巨噬细胞和树突状细胞在两种基因型的DDC饮食诱导的胆汁淤积肝中同等增加。巨噬细胞和中性粒细胞增加也通过IBA1（泛巨噬细胞标记）和MPO（中性粒细胞标记）免疫染色得到证实。这些数据表明，胆汁淤质导致 resident库普弗细胞和B细胞减少，并增加了浸润髓系细胞的比例。总体而言，肝脏免疫景观从正常肝环境中的淋巴细胞中心表型转变为胆汁淤积肝中的髓系细胞中心表型，且WT和 Il-17a-/-小鼠之间具有可比性。重要的是，虽然总T细胞群体在DDC喂养的WT小鼠中下降，但其在 Il-17a-/-小鼠中的数量保持不变。
Immune cells from cholestatic mice Il-17a-/-express a profibrogenic gene signature that includes LIGHT (Tnfsf14)**
Il-17a缺失对DDC饮食诱导的胆汁淤积性肝损伤最明显的影响是突变小鼠中纤维化增强。为了解改变的免疫细胞环境是否促进了促纤维化反应，使用从IHL分离的总RNA进行了多重基因表达分析 (NanoString)。差异表达基因的热图突出了WT和 Il-17a-/-小鼠之间的基因表达差异。WT和 Il-17a-/-胆汁淤积小鼠与各自对照饮食喂养小鼠相比，细胞外基质合成和降解相关基因（如 Mmp12, Mmp8, Mmp7, Mmp13,和 Fn1）均上调。同样，细胞因子 Cxcl2和DAMP S100a4在WT和 Il-17a-/-胆汁淤积小鼠中均上调。为识别胆汁淤积WT和 Il-17a-/-小鼠之间特异性差异表达的基因构建的火山图表明，主要促炎细胞因子如 Ifng, Il1b和 Tnf的表达水平无差异。值得注意的是，只有七个基因，即 Il18r1, Trat1, Tnfsf14, Thbs1, Ccr4, Il2ra和 Icos在胆汁淤积 Il-17a-/-小鼠中上调。已知可促进肝纤维化的基因 Tnfsf14（编码蛋白LIGHT）在IHL中表达增加，并通过qRT-PCR得到证实。
接下来，通过流式细胞术确定LIGHT是否在特定的免疫细胞区室中表达。总IHL在所有胆汁淤积小鼠中均升高，Il-17a-/-小鼠每克肝重的细胞数更多。CD45+免疫细胞在喂食对照或DDC饮食的所有小鼠中检测到的数量相等。在免疫细胞中，LIGHT阳性仅见于CD4+T细胞和NK T细胞，分别约占CD45+免疫细胞总数的8%和1%。LIGHT在NK细胞、CD8α+T细胞、中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞中缺失或极少表达。由于LIGHT+NK T细胞群体数量少且不随胆汁淤积改变，研究聚焦于CD4+T细胞及其亚群。与质谱流式细胞术数据一致，总CD4+T细胞在所有胆汁淤积小鼠中均减少。然而，LIGHT+CD4 T细胞的丰度在胆汁淤积WT和 Il-17a-/-小鼠中呈增加趋势，表明该T细胞亚群可能促进了与胆汁淤积相关的纤维化增加。进一步分析表明，虽然LIGHT由所有CD4+T细胞亚群（Th1、Th2、Th17和T-regs）表达，但仅在胆汁淤积小鼠的极化Th1亚群中，LIGHT阳性率从约50%显著增加至100%。
为了更全面地表征IL-17A对Th1 CD4+T细胞中LIGHT表达的调节作用，分离WT小鼠脾细胞并用PMA/ionomycin组合刺激以最大程度激活诱导IFNγ表达（Th1极化T细胞的标志性特征）。经PMA/ionomycin处理的CD4 T细胞群体显示IFNγ+CD4+T细胞丰度增加，同时IFNγ+亚群中LIGHT+细胞增加了十二倍，而IFNγ-亚群无增加。此外，在对照条件下，Il-17a-/-小鼠的IFNγ+CD4+T细胞比WT小鼠增加。相应地，Il-17a-/-小鼠该亚群中LIGHT+T细胞的比例显著高于WT小鼠。这些数据暗示了Th1 CD4+T细胞中LIGHT表达与IL-17A负向调节之间的关系。
最后，用重组LIGHT刺激原代人星状细胞诱导了促纤维化基因 ACTA2、COL1A1、PDGFRA和 CTGF的表达，表明LIGHT在成纤维细胞激活和纤维化中的作用可能是直接的。这些观察结果表明表达LIGHT的Th1 CD4+T细胞与胆汁淤积性肝纤维化之间存在关联。
Discussion
本研究的结果为IL-17A在DDC小鼠模型中调节胆汁淤积性肝损伤的作用提供了关键的机制见解。本研究的主要发现如下：Il-17a的基因缺失加剧了肝纤维化；对IHL群体的NanoString分析发现促纤维化细胞因子LIGHT表达增加；CD4+T细胞是IHL群体中LIGHT的主要来源，并且在Th1 CD4+T细胞中LIGHT表达增强。
小鼠胆汁淤积性肝损伤模型并不能重现人类胆汁淤积性肝病的所有特征。本研究选择使用DDC小鼠模型，因为该模型能引发显著的胆管增生和门管区纤维化，这是人类胆汁淤积性肝病的显著特征。本研究的一个局限性是观察结果尚未在其他模型中得到证实。
Il-17a的种系缺失加剧了肝纤维化，但未改变DDC喂养小鼠胆汁淤积性肝损伤的其他特征。这表明IL-17A在胆汁淤积期间直接或间接地抑制肝纤维化。由于IL-17A直接激活小鼠肝星状细胞，其基因缺失预期会减少纤维化，但这与本研究观察到的效应相反。由于IL-17A是一种免疫调节细胞因子，研究对IHL中的促纤维化介质进行了分析，发现在缺乏IL-17A时促纤维化细胞因子LIGHT增加。LIGHT的来源是CD4+T细胞，因为所有被检测的亚群，包括Th1和Th2极化的CD4+、Th17和T调节细胞均表达LIGHT。因此，IL-17A抑制纤维化的作用似乎是通过调节CD4+T细胞的效应功能间接实现的。
LIGHT表达在胆汁淤积期间的增加仅在Th1极化的CD4+T细胞中观察到。这一观察结果与报道一致，即转录因子NFAT促进原代小鼠CD4 T细胞中Th1样基因表达模式，并且已知NFAT可增强LIGHT表达。此外，已知LIGHT可诱导巨噬细胞产生促纤维化的TGFβ，且本研究证明LIGHT可能直接激活原代HSC。这些数据表明Th1极化的CD4+T细胞可能通过表达LIGHT促进胆汁淤积性纤维化。LIGHT是否足以促进胆汁淤积性纤维化，或者是否如肺成纤维细胞中报道的那样与其他介质协同作用，需要进一步阐明。我们还注意到这些研究仅确定了LIGHT表达与胆汁淤积性纤维化之间的关系，需要条件性LIGHT基因敲除小鼠（尚未开发）来进一步阐明机制关系。
尽管LIGHT在多种组织中被充分证实具有促纤维化作用，但在肝损伤或纤维化中的研究尚不充分。一项研究表明LIGHT基因缺陷改善了高脂高胆固醇饮食喂养小鼠的肝脂肪变性。相反，另一项研究将脾切除术后循环LIGHT浓度下降与肝纤维化消退相关联。最近，LIGHT被证明可驱动肺成纤维细胞中的促炎转录组特征。这些数据与LIGHT受体在负责组织纤维化的细胞类型上更普遍的表达一致。我们还注意到LIGHT可能由胆汁淤积中激活的胆管细胞表达，作为该促纤维化配体的另一个细胞来源。尽管如此，在本研究中我们证实LIGHT可以促进原代人肝星状细胞中促纤维化基因的表达。LIGHT与其他促纤维化介质相比的相对贡献，以及其在胆汁淤积性纤维化中的主要细胞来源，需要进一步探索。
本研究有三个主要意义。首先，鉴于本研究证明IL-17A缺失会增强胆汁淤积性纤维化，在PSC等胆汁淤积性肝病中针对IL-17A及其他家族成员的抗IL-17疗法可能不可取。其次，靶向CD4+T细胞以减少PSC以外的胆汁淤积性肝病中的肝纤维化需要进一步探索。最后，LIGHT对肝纤维化的贡献似乎很重要；因此，功能性抑制该细胞因子的作用是减轻肝纤维化的潜在策略。
Acknowledgments
非常感谢Courtney Hoover女士的行政协助。
