AP180组装结构域通过肌动蛋白结合调控突触囊泡尺寸与释放的机制研究

《PLOS Biology》：Endocytic protein AP180 assembly domain regulates synaptic vesicle size and release in Caenorhabditis elegans

本研究揭示内吞蛋白AP180的C端组装结构域（AD）通过相分离（LLPS）介导肌动蛋白（actin）成核与膜锚定，精准调控突触囊泡尺寸，进而影响囊泡曲率感知蛋白complexin（CPX-1）对自发释放的抑制作用，为突触可塑性及神经退行性疾病研究提供新视角。

　　

引言

神经元通讯依赖于突触囊泡精准的神经递质释放。囊泡尺寸的均一性（直径约30–50 nm）是突触传递量化特性的结构基础，但其形成机制及功能意义尚不明确。内吞蛋白AP180（线虫中同源蛋白为UNC-11）在囊泡回收中起关键作用，其缺失会导致囊泡增大、递质释放异常。AP180的C端组装结构域（Assembly Domain, AD）为内在无序区域，此前研究提出其可能通过空间位阻效应促进膜弯曲，但AD是否通过特异性分子相互作用调控囊泡尺寸仍待阐明。

UNC-11缺失引起突触传递与囊泡尺寸异常

通过CRISPR-Cas9构建线虫unc-11缺失突变体（pek217），电生理记录显示其诱发兴奋性突触后电流（evoked EPSC）振幅和自发性EPSC频率显著降低，但自发性EPSC振幅增大，与小鼠、果蝇中ap180缺失表型一致。电镜分析证实突变体突触囊泡直径增至40.4±0.2 nm（野生型为32.1±0.2 nm），并出现内体样结构，表明UNC-11为维持囊泡正常尺寸所必需。

AD缺失特异性破坏囊泡尺寸调控而非内吞功能

在unc-11突变体中表达缺失AD的UNC-11变体（UNC-11?AD），发现其可完全恢复囊泡蛋白回收速率（VGLUT-pHluorin实验），但无法纠正囊泡增大（直径40.2±0.3 nm）和量化振幅升高（37±2 pA）。意外的是，UNC-11?AD反而提升运动速度和突触释放频率（ endogenous EPSC频率75±5 Hz，高于野生型的53±3 Hz），表明AD对自发释放具有抑制作用，且其尺寸调控功能独立于内吞活性。

增大囊泡逃逸complexin的曲率依赖性抑制

Complexin（CPX-1）通过感知膜曲率抑制自发释放。在UNC-11?AD突变体中，删除cpx-1基因不再进一步增加释放频率，说明增大囊泡已逃逸CPX-1的抑制作用。而通过RAB-3将CPX-1锚定于囊泡膜可恢复其抑制功能，证实囊泡尺寸变化通过影响CPX-1的曲率依赖性定位而非SNARE结合能力调控释放动力学。

AD尺寸调控功能依赖肌动蛋白互作而非单纯空间位阻

将AD替换为神经丝蛋白无序区（NfM-CD）仅部分改善囊泡尺寸，而替换为同源蛋白HIPR-1或Epsin1的C端结构域则可显著恢复尺寸正常化。进一步发现HIPR-1的THATCH结构域（含肌动蛋白结合基序）为此功能关键：删除THATCH或向UNC-11?AD融合短肽Lifeact（肌动蛋白结合肽）均可分别破坏或挽救囊泡尺寸与释放表型，证明肌动蛋白结合是AD功能的核心机制。

UNC-11相分离凝聚体介导肌动蛋白成核与膜锚定

生化实验显示，UNC-11 AD及全蛋白均可形成液-液相分离（LLPS）凝聚体，富集单体G-actin并加速F-actin成核。全长度UNC-11凝聚体能同时结合PI(4,5)P₂脂质体与F-actin，形成“膜-蛋白-细胞骨架”三元复合物，提示其通过相分离空间偶联内膜系统与肌动蛋白网络，协同驱动囊泡成型。

讨论

本研究揭示了AP180 AD通过肌动蛋白结合调控囊泡尺寸的新机制，并阐明了尺寸变化如何通过影响complexin的曲率感知功能改变释放概率。AD的相分离特性可能优化了肌动蛋白成核的时空精度，而其与HIPR-1、Epsin1等蛋白的功能互换性提示内吞机器存在协同进化模块。该机制缺陷可能与神经退行性疾病中突触衰竭相关，为干预策略提供新靶点。