《PLOS Biology》：Grik2b and Grik2c kainate receptors regulate oviposition in Bactrocera dorsalis
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本研究揭示了一个调控橘小实蝇产卵行为的新型神经传导机制。研究发现，在谷氨酸能神经元和产卵器神经肌肉接头中表达的两种红藻氨酸受体通过感知谷氨酸信号，分别调控了产卵偏好和产卵数量。该机制为害虫防控提供了新的潜在分子靶点。
引言
产卵对于昆虫的繁衍、种群维持和物种繁荣至关重要。理解雌性昆虫的产卵机制对于物种传播和害虫防治具有重要意义。产卵过程的执行需要外周感觉系统与中枢神经系统的协调。尽管多种感觉系统和受体已被证实能引导昆虫产卵，但关于内部神经元和环路参与产卵决策的研究主要局限于果蝇，且多种受体以神经递质依赖的方式参与神经元与靶器官之间的通讯。
虽然中枢神经系统是产卵的决策中心，但产卵器的作用也不容忽视。研究表明，多种昆虫的产卵器上存在气味受体。尽管对产卵器内参与气味识别的外周受体有一定了解，但与产卵相关的内部神经元仍不清楚。
在果蝇中，谷氨酸已被证实能通过内部感觉神经元和腹部神经节神经元驱动产卵运动程序。谷氨酸是中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质，其作用主要由三类离子型谷氨酸受体介导，分别是AMPA受体、红藻氨酸受体和NMDA受体。昆虫iGluRs的克隆揭示了它们与脊椎动物AMPA、kainate和NMDA受体对应物具有序列相似性。然而，除果蝇幼虫的神经肌肉接头和成年蝗虫的神经肌肉接头外，昆虫神经元的微小尺寸和难以接近性对表征天然昆虫iGluRs的功能特性构成了挑战。在果蝇中，四个假定的KARs对光谱偏好行为是功能上不可或缺的。然而，迄今为止，尚未在体外成功重建这些假定的KARs。
橘小实蝇是一种对水果和蔬菜生产造成重大损害的重要害虫。通常，橘小实蝇的雌虫利用其锥形产卵器将卵产在果实深处，从而对果实造成损害。研究表明，怀孕的橘小实蝇雌虫对含有肠道细菌和特定挥发物的寄主果实表现出明显的产卵偏好。本研究通过鉴定在谷氨酸能神经元和产卵器神经肌肉接头中表达的两种受体，为橘小实蝇产卵行为改变的神经传导机制提供了强有力的支持证据。
结果
KARs在怀孕雌虫产卵器中高表达
通过不同发育阶段产卵器的转录组分析，筛选了与产卵相关的基因。结果显示，不同发育阶段的产卵器基因表达模式存在显著差异，年龄越接近，与怀孕雌虫的基因表达模式相似性越高。基因表达趋势分析生成了20个不同的基因表达谱，其中754个基因在年长雌虫的产卵器中表达水平较高。随后的基因本体分析表明，这些基因在膜成分和信号转导相关术语中显著富集。值得注意的是，在这些术语中发现了三个KARs，它们在年长雌虫的产卵器中高表达。组织表达研究表明，Grik2b和Grik2c特异性地在怀孕雌虫的产卵器中表达。KARs作为一类iGluRs，被认为介导谷氨酸的作用。然而，除了它们对果蝇光谱偏好行为的影响外，关于KARs在昆虫中的功能研究有限。鉴于它们在怀孕雌虫产卵器中的高表达，我们假设它们可能影响橘小实蝇的产卵行为。
产卵器NMJs表达的Grik2b和Grik2c调控怀孕雌虫的产卵行为
为了验证受体的功能，我们首先与黑腹果蝇进行了比较序列分析。系统发育分析显示，橘小实蝇的三个KARs聚集成两个主要家族，其中Grik2b和Grik2c被归类于果蝇NMJ GluR组。氨基酸比对表明，Grik2b和Grik2c都具有两个LBD多肽，与其他昆虫物种具有高度相似性。对产卵器微观结构的切片检查揭示了被神经元包裹的肌肉细胞。免疫荧光分析进一步说明了肌肉纤维和神经纤维的交织排列。透射电子显微镜结果表明，肌肉细胞和神经元轴突密切关联，在产卵器中形成NMJ结构。原位杂交也证实了Grik2b和Grik2c在产卵器NMJs的肌肉细胞中表达。然后，利用木笼评估雌虫的产卵行为。在dsRNA注射72小时后，产卵器中Grik2b或Grik2c的表达降低，这对雌虫的运动没有影响。然而，产卵器伸出的频率和持续时间显著减少，从而减少了产卵数量。卵巢解剖显示，敲低Grik2b/c并未导致雌虫卵巢内卵子数量的减少。此外，在敲低Grik2b或Grik2c的雌虫中，也观察到对含有肠道细菌的水果的产卵偏好显著下降。额外的多个非重叠RNAi构建体也显示出一致的表型，这使得脱靶效应的可能性极低。然而，在Grik2a敲低的雌虫中未观察到对产卵的影响。为了确定Grik2b和Grik2c对产卵的普遍影响，我们测量了已知对雌虫具有产卵吸引和排斥作用的3-HA和EC在Grik2b和Grik2c敲低雌虫中的效应。结果显示，产卵数量显著减少，并且3-HA的产卵吸引效应在Grik2b和Grik2c敲低的怀孕雌虫中被消除。类似地，对于EC，也观察到产卵数量显著减少，导致两种Grik2b和Grik2c敲低的怀孕雌虫的产卵排斥效应显著降低。在转录组中，我们还注意到与肌肉发育和收缩相关的基因在雌虫产卵器中显著高表达。敲低这些基因导致产卵量显著减少。然而，敲低Grik2b/c并未改变这些肌肉发育和收缩相关基因的表达，这表明Grik2b/c对产卵的影响独立于这些肌肉相关基因的转录调控。
谷氨酸作为与Grik2b和Grik2c结合的神经递质
作为动物体内主要的兴奋性神经递质，谷氨酸的作用可由KARs介导。我们假设谷氨酸可能是Grik2b和Grik2c的配体。为了验证这一点，构建了Grik2b和Grik2c的LBDs同源模型。然后使用Autodock Vina预测了Grik2b和Grik2c与谷氨酸的结合特性。模型构建质量评估结果显示，Grik2b和Grik2c分别有99.5%和99.2%的氨基酸位于Ramachandran图的最优和次优区域，表明构建的蛋白质模型可用于对接分析。对接结果显示，谷氨酸与Grik2b的THR-57、GLY-58、THR-87和ARG-92残基之间形成氢键，亲和力为-5.2 kcal/mol。对于Grik2c，谷氨酸与ARG-65、TYR-66、THR-95、ARG-98和GLY-141残基之间形成氢键，亲和力为-4.6 kcal/mol。为了进一步探索Grik2b和Grik2c与谷氨酸的配体结合能力，我们使用纯化的可溶性Grik2b和Grik2c LBDs进行了蛋白酶解保护实验。结果显示，正如预期的那样，8 mM谷氨酸有效防止了胰蛋白酶对LBDs的消化。然后，进一步应用微量热泳动和表面等离子体共振来测试Grik2b和Grik2c LBDs与谷氨酸的结合能力。结果也显示，Grik2b和Grik2c LBDs能高效结合谷氨酸。此外，表达Grik2b和Grik2c的非洲爪蟾卵母细胞对谷氨酸产生更强的反应，尽管对照卵母细胞也对谷氨酸有反应。由于谷氨酸脱氢酶和谷氨酸合成酶参与昆虫体内谷氨酸的产生，我们通过分别敲低GluDH和GluSN的表达进一步研究了谷氨酸对产卵行为的影响。结果显示，dsRNA注射72小时后，产卵器中GluDH和GluSN的表达显著降低。相应地，产卵器中的谷氨酸水平显著下降。行为实验表明，敲低GluDH和GluSN的表达对雌虫的运动没有影响，而在GluDH和GluSN敲低的雌虫中，产卵数量和针对添加了肠道细菌的水果的产卵偏好显著降低。这些结果证明，谷氨酸是激活Grik2b和Grik2c的神经递质，并影响雌虫的产卵。
GNs中Grik2b和Grik2c的表达控制产卵偏好
受体在产卵器NMJs中的表达可能通过调节肌肉收缩来影响产卵数量。然而，该受体也调控产卵偏好，这表明该受体可能表达在调节产卵偏好的上游神经元中。Grik受体对谷氨酸的反应，以及它们在类似系统中与GNs标记物共表达的记载，促使我们研究它们在我们模型中的潜在存在和作用。尽管qPCR结果显示Grik2b/2c在胸部组织中的表达水平较低，但我们推测Grik2b/2c可能只在胸部的特定GNs亚群中表达以调节产卵偏好。因此，利用FISH确定了Grik2b、Grik2c和囊泡谷氨酸转运体在雌虫大脑和腹神经索中的表达定位。结果表明，Grik2b、Grik2c和Vglut在雌虫大脑和腹神经索的GNs中共表达，尽管在头部和胸部的qPCR中未检测到。然而，Vglut在产卵器的产卵瓣基部未与Grik2b和Grik2c共定位。组织表达调查也显示，Vglut主要在雌虫含有中枢神经系统的部分表达。鉴于Vglut是GNs的特异性标记基因，可以得出结论，Grik2b和Grik2c也在GNs中表达，并可能在影响产卵偏好中发挥作用。RNAi实验证明，敲低Vglut表达可以消除对添加肠道细菌的水果的产卵偏好，而对总产卵数量没有影响，这表明GNs调节雌虫的产卵偏好。腹神经索中钙离子信号检测的结果也表明，沉默Grik2b、Grik2c和Vglut的表达可导致GNs中钙信号减弱。此外，将靶向Grik2b或Grik2c的dsRNA注射到胸部12小时后，可以特异性地导致中枢神经系统中Grik2b或Grik2c的表达减少，而对产卵器中的表达没有影响。相应地，雌虫对添加了肠道细菌的水果的产卵偏好会降低，而总产卵数量保持不变。然而，将dsRNA注射到胸部24小时后，中枢神经系统和产卵器中Grik2b或Grik2c的表达都会减少。相应地，雌虫对添加了肠道细菌的水果的产卵偏好和总产卵数量发生显著变化。此外，将Grik2b或Grik2c dsRNA注射到腹部仅6小时后，只会导致产卵器中Grik2b或Grik2c的下调。因此，总产卵数量受到显著影响，而产卵偏好则没有。然而，将dsRNA注射到腹部12小时后，中枢神经系统和产卵器中Grik2b或Grik2c的表达都会减少。相应地，雌虫对添加了肠道细菌的水果的产卵偏好和总产卵数量发生显著变化。这些发现表明，表达Grik2b和Grik2c的GNs和产卵器分别负责对受肠道细菌感染的水果的产卵偏好和产卵数量。
抑制剂通过与KARs相互作用调节产卵
我们进一步筛选了KAR抑制剂并评估了它们对产卵的影响。在脊椎动物的研究中，D-AP5和NBQX分别是NMDA受体和AMPA/KARs的选择性拮抗剂。然而，在果蝇中的研究表明，KARs可以被D-AP5抑制。系统发育分析显示，Grik2b和Grik2c与果蝇中的KARs具有高度相似性。因此，我们选择了这两种拮抗剂来评估它们对Grik2b/c的抑制效果。对接结果显示，所选配体与Grik2b之间存在氢键。在已识别的结合位点中，ARG-92、THR-87和/或THR-57被发现是谷氨酸与Grik2b的共同结合位点。此外，在所选配体与Grik2c之间也观察到氢键。TYR-66、THR-95、ARG-98和/或GLY-141是谷氨酸与Grik2c的共同结合位点。D-AP5和NBQX对Grik2b和Grik2c的亲和力高于谷氨酸。蛋白酶解保护实验显示，在浓度为4和8 mM时，D-AP5和NBQX可防止胰蛋白酶消化Grik2b LBDs。对于Grik2c，只有NBQX在浓度为4和8 mM时显示出防止胰蛋白酶消化的作用。MST和SPR显示，Grik2b LBDs与所有选定的抑制剂均表现出结合能力，尽管亲和力低于谷氨酸。类似地，对于Grik2c，所有抑制剂都表现出与LBDs的结合能力，亲和力低于谷氨酸。当注射到怀孕雌虫的腹部时，所有抑制剂都导致对添加了肠道细菌的水果的产卵偏好和产卵数量显著下降。这些结果表明，选定的抑制剂可以结合Grik2b和Grik2c，从而影响产卵。
讨论
昆虫嗅觉系统易于进行基因操作，这促进了对气味驱动行为（包括产卵偏好）的分子和细胞基础日益深入的探索。我们的研究通过揭示KARs在GNs和NMJs中的双重作用，为产卵的神经传导机制提供了强有力的支持证据。我们提供的证据表明，GNs和产卵器NMJs通过KARs接收兴奋性谷氨酸能信号来调节产卵。我们现在将我们的发现与关于果蝇产卵的研究进行明确比较。我们在橘小实蝇中的研究证实了谷氨酸信号，特别是通过Grik受体的广泛重要性。这一发现有力地证实了在果蝇中的发现，表明这一信号通路可能在昆虫产卵行为中具有深刻的进化保守性。
作为iGluRs的一个亚型，昆虫KARs已经过功能验证实验，显示出与脊椎动物不同的配体结合特性，这表明KARs在昆虫中具有新功能。对黑腹果蝇和沙漠蝗的研究表明，iGluRs介导NMJ的突触传递，导致突触后膜去极化。随后，在美洲大蠊和飞蝗的中位神经元中发现了类似的谷氨酸受体。尽管最近在昆虫中发现了许多iGluRs，但它们的功能特性仍未得到充分验证，特别是在昆虫行为方面。研究表明，KAR在昆虫中显著扩展，这些受体的功能仅被假设与昆虫的中枢神经系统和NMJ有关。迄今为止，关于KAR在昆虫中的生物学功能的研究甚至更少，只有两篇系统性的报告记载了KAR在果蝇眼中的表达及其参与光感知。我们的研究进一步揭示了GN和产卵器NMJ中的KARs调节产卵，进一步证实了KAR的新功能和重要作用。
昆虫的雌性生殖系统特点是广泛的肌肉化和神经元突触的复杂神经支配。对飞蝗和黑腹果蝇的研究表明，产卵行为受中枢神经系统对相关肌肉组织的控制调节。中枢神经系统内的神经元可以通过在NMJ释放神经递质来调节与产卵相关的生殖组织。例如，章鱼胺通过调节生殖道的收缩和扩张来影响卵子从卵巢的排出。类似地，谷氨酸已被证明与昆虫中许多驱动肌肉收缩的运动神经元共定位。鉴于KARs被归类于NMJ GluR组，它们对产卵器NMJs肌肉收缩的破坏可能解释了它们对产卵数量的影响。
昆虫对挥发物的产卵偏好已被广泛研究，强调了嗅觉系统的关键作用。然而，对产卵神经传导机制的理解仍然相当有限。在我们的研究中，我们证明GNs中的KARs传递产卵偏好信号。在黑腹果蝇中，已揭示KAR介导对紫外光的偏好。我们的研究进一步证明，中枢神经系统和GNs中的KARs在调节产卵偏好中发挥作用，这表明KARs可能在负责将细菌和挥发物相关的产卵偏好信号传递给GNs的神经元中发挥功能性作用。
然而，这项研究也提出了值得进一步研究的问题。鉴于谷氨酸对产卵行为的影响以及观察到的RNAi对GluSN基因在调节该行为中的影响，有必要探索谷氨酸合成途径在产卵过程中产卵器功能中的作用。这项研究通过群体钙成像揭示了谷氨酸能信号在腹神经索整体兴奋性中的基本调节作用。然而，由于在非模式生物中缺乏细胞类型特异性的遗传工具，我们目前无法解析这一调节过程中更精细的时间动态。未来，随着跨物种遗传工具和高速成像技术的发展，阐明这些毫秒级别的动态特征对于理解谷氨酸如何精确塑造行为输出的时间结构至关重要。建立产卵偏好和产卵数量之间功能分离的金标准是进行拯救实验。例如，这可以通过普遍敲除或敲低一个基因，然后仅在中枢神经系统和GNs中恢复其表达来实现。证明偏好得到恢复而产卵数量不受影响将提供证据。然而，目前，这样的工具尚未用于橘小实蝇。虽然我们的研究表明，通过胸部注射药理抑制Grik受体可有效抑制产卵，但这种方法不适用于实地应用。未来的工作对于开发可部署的递送策略至关重要，例如配制稳定的口服活性Grik拮抗剂，可将其纳入诱饵站或喷雾剂中。本研究中将Grik确定为有效靶点为这些应用性工作提供了关键基础。
