《PLOS Biology》：A gut-activated NHR-86–CYP pathway mediates the neuroprotective effects of Enterococcus faecium probiotics in a nematode model of amyotrophic lateral sclerosis
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本研究揭示了益生菌粪肠球菌（Enterococcus faecium）通过激活肠道核激素受体NHR-86（人类HNF4同源物）调控细胞色素P450（CYP）基因表达，从而在线虫sod-1 A4VM肌萎缩侧索硬化（ALS）模型中抵抗氧化应激诱导的运动神经元退行性变。该发现首次阐明了肠道微生物信号通过NHR-CYP轴间接保护神经元的全新机制，为神经退行性疾病防治提供了新靶点。
Abstract
神经退行性疾病常与氧化应激相关，益生菌可能影响神经元健康，但其潜在机制尚不清楚。本研究利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的sod-1 A4VM肌萎缩侧索硬化（ALS）模型，探讨了益生菌粪肠球菌（Enterococcus faecium）对氧化应激诱导的神经退行性变的保护作用。与维持标准大肠杆菌（Escherichia coli）饮食的动物相比，喂食E. faecium的动物在氧化应激下运动神经元退行性变减少。转录组分析显示氧化还原酶基因显著富集，包括细胞色素P450（cyp）基因。RNAi介导的cyp基因敲低损害了E. faecium介导的神经保护作用，且这种损失与活性氧（ROS）水平增加相关。我们鉴定出保守的核激素受体NHR-86是cyp基因表达和神经保护的关键调节因子。nhr-86的缺失消除了益生菌的保护益处，而nhr-86的转基因表达恢复了cyp诱导和神经元韧性。重要的是，NHR-86的肠道表达足以恢复CYP诱导和神经元韧性，而神经元敲低则无影响，表明肠道NHR-86活性对此保护通路至关重要。这些发现揭示了一条先前未表征的、由肠道益生菌激活的NHR-CYP调节轴，凸显了微生物信号与宿主神经保护之间的机制联系。
Introduction
神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化（ALS），会渐进性损害神经系统，导致严重的身体和认知障碍。ALS是一种致命的神经退行性疾病，以运动神经元退行性变为特征，导致肌肉萎缩、无力、吞咽困难、构音障碍、呼吸困难、肢体运动障碍，并在晚期最终瘫痪。呼吸衰竭和死亡通常发生在2-3年内。超过40种基因突变与ALS相关。其中，最常见的遗传原因是染色体9开放阅读框72（C9orf72）六核苷酸重复扩增，其次是TAR DNA结合蛋白和肉瘤中融合（FUS）基因的突变。SOD1突变约占家族性ALS的10%–20%和所有ALS病例的1%–2%。然而，很少有临床治疗或预防策略专门针对SOD-1。SOD-1 A4V突变是美国最常见的SOD-1突变，约占病例的50%。它在哺乳动物中保守，是第一个被鉴定的SOD-1突变，并且仍然是SOD-1相关病例中ALS的主要原因。在此，我们利用携带单拷贝SOD-1 A4V突变并因氧化应激表现出更高程度退行性变的sod-1 A4VM模型，研究了益生菌在预防运动神经元退行性变中的保护作用。
我们使用秀丽隐杆线虫作为研究神经退行性变的强大模式生物，因其简单且特征明确的神经系统。其透明的身体和短寿命允许实时观察神经元功能和退行性变，使其成为研究神经退行性疾病机制的理想选择。引入人类疾病突变（如与ALS相关的突变）的能力进一步增强了其在模拟运动神经元退行性变方面的实用性。
积累的证据表明，益生菌通过调节关键的生理过程在人类健康和福祉中发挥着至关重要的作用。其中，益生菌已被证明能增强对氧化应激的抵抗力，而氧化应激是运动神经元退行性变的主要促成因素。肠球菌，特别是粪肠球菌，因其对宿主健康的有益作用而被广泛用作益生菌。我们最近的研究表明，E. faecium通过激活Wnt通路（细胞稳态的关键调节因子）有效保护宿主免受致命的肠沙门氏菌（Salmonella enterica）感染。这些发现表明E. faecium可能在体内提供神经保护益处，潜在地减轻由氧化损伤引起的神经退行性疾病。
细胞色素P450（CYP）家族在减少自由基和影响神经退行性疾病中起着关键作用。虽然一些CYP酶有助于氧化应激，但其他CYP酶能解毒活性氧（ROS）、调节脂质代谢和清除有毒代谢物，使其成为神经保护疗法的潜在靶点。越来越多的证据将CYP表达模式与大脑活动和神经功能联系起来。例如，CYP46A1已被确定为阿尔茨海默病的治疗靶点，表明其可能影响疾病进展。在帕金森病中，CYPs表现出既有保护作用也有有害作用，进一步凸显了其作用的复杂性。总体而言，CYP介导的内源性代谢与神经退行性疾病密切相关，并在中枢神经系统中发挥重要作用，影响类固醇合成、炎症和药物代谢。
核激素受体（NHRs）是转录因子，在结合特定的外源性或内源性配体后控制基本的生物过程。在肠道中过表达NHRs可以减轻运动神经元退行性变，NHRs介导了丙酸盐在帕金森病线虫模型中对α-突触核蛋白诱导的神经元死亡的保护作用。此外，最近的研究表明NHR激活调节神经元存活通路和线粒体稳态，突显了它们作为神经退行性疾病治疗靶点的潜力。
利用秀丽隐杆线虫中的单拷贝ALS SOD-1敲入模型，我们研究了E. faecium在氧化应激下对运动神经元退行性变的保护作用。我们发现暴露于E. faecium引发了细胞色素P450基因的广泛诱导。这些CYPs通过减少氧化应激期间的细胞内ROS水平来促进E. faecium介导的神经保护。我们鉴定出NHR-86，一个保守的NHR和人类肝细胞核因子4（HNF4）的同源物，是这一反应的关键调节因子。NHR-86通过响应E. faecium激活CYP基因来防止运动神经元退行性变。NHR-86的肠道功能是CYP诱导和神经元韧性所必需的，支持了肠道氧化应激缓解在神经元保护中的间接作用。总之，这些发现揭示了一种涉及CYP激活的新型神经保护机制，并提出了靶向神经退行性疾病的潜在策略。
Results
E. faecium protects C. elegans against motor neuron degeneration under oxidative stress
SOD-1 A4V突变是北美ALS患者中最普遍的疾病相关SOD-1等位基因。携带此突变的患者通常经历胆碱能脊髓运动神经元的选择性退行性变和死亡，而谷氨酸能神经元保持功能。类似地，在线虫中，sod-1 A4VM模型在氧化应激下表现出胆碱能运动神经元丢失，谷氨酸能神经元不受影响。此外，在sod-1(-)背景下的单拷贝sod-1 A4VM敲入动物显示出比相同遗传背景下的sod-1 WTM敲入动物明显更高的氧化应激敏感性，表现出加速的神经退行性表型，为检测运动神经元退行性变提供了可靠模型。在基础条件下，单拷贝SOD-1 A4VM模型在年轻成年动物中不显示胆碱能运动神经元丢失或功能缺陷，表明该模型中的神经退行性变主要是应激依赖性的。因此，我们选择ALS sod-1 A4VM模型来研究益生菌E. faecium在氧化应激（使用百草枯诱导）下对胆碱能运动神经元完整性的影响。百草枯暴露后，一些sod-1 A4VM动物表现出胆碱能运动神经元缺陷。为了测试E. faecium是否在氧化应激下保护秀丽隐杆线虫免受胆碱能运动神经元退行性变，动物在用百草枯平板处理前用E. faecium预处理24小时。大肠杆菌，一种用于实验室维持秀丽隐杆线虫的细菌食物，被用作对照。使用携带unc-17p::GFP基因的动物研究胆碱能运动神经元完整性，该基因在胆碱能神经元中表达荧光蛋白。用E. coli或E. faecium预处理的sod-1 WTM动物中，显示运动神经元退行性变的比例均低于10%，两种处理之间无显著差异。用E. coli预处理的sod-1 A4VM动物中有50%显示运动神经元退行性变，而用E. faecium预处理的sod-1 A4VM动物中只有20%显示运动神经元退行性变。重要的是，我们发现UV灭活和热灭活的E. faecium均未能提供神经保护，表明活的E. faecium是这种保护效应所必需的。
我们还评估了E. faecium介导的神经保护是否在氧化应激期间促进存活。用E. faecium处理的动物比用E. coli处理的动物存活得明显更好。由于E. faecium保护运动神经元免受神经退行性变，我们研究了E. faecium处理是否影响运动。动物用E. faecium预处理，然后进行百草枯诱导的氧化应激。E. faecium挽救了氧化应激诱导的运动缺陷。这些结果表明益生菌E. faecium在氧化应激下保留了胆碱能运动神经元完整性和运动功能。
由于携带SOD1 A4V突变的ALS患者表现出谷氨酸能神经元丢失，我们接下来检查了E. faecium是否保护这些神经元。使用sod-1 G85RM谷氨酸能神经退行性变模型，我们研究了感觉谷氨酸能神经元PHA和PHB，这些神经元在百草枯诱导的氧化应激下易发生退行性变。E. faecium处理减少了这些神经元的退行性变，表明其神经保护作用超出了胆碱能运动神经元。
Classic immune pathways are not required in probiotic-mediated neuroprotection
为了鉴定E. faecium介导的神经保护中所需的基因和通路，我们进行了转录组分析，比较了用E. faecium处理和用E. coli处理的sod-1 A4VM动物。在302个差异调节基因中，227个在暴露于E. faecium时上调，75个下调。为了鉴定直接或间接受E. faecium暴露调节的相关基因群，我们使用DAVID数据库进行了无偏基因富集分析。响应E. faecium暴露的下调基因子集中，最高度富集的簇与先天免疫反应和跨膜运输相关，其次是脂质运输、S-腺苷甲硫氨酸生物合成和一碳代谢过程。对于上调基因集，得分最高的本体论簇包括氧化还原酶活性和水解酶活性，其次是涉及铁离子结合和角质层结构成分的基因等。正如预期，使用专门用于秀丽隐杆线虫基因数据分析的Wormbase富集分析工具也观察到类似的富集。先天免疫反应基因和氧化还原酶活性基因分别在下调基因和上调基因中高度富集。此外，我们将我们的富集分析与一项类似研究进行了比较，该研究检查了E. faecium和热灭活E. coli处理的野生型动物之间的基因表达差异。我们发现了可比的结果。
我们使用qRT-PCR验证基因表达，从两个关键簇中选择候选基因：先天免疫反应簇（顶部下调）和氧化还原酶活性簇（顶部上调）。这些基因在四种条件下进行评估：sod-1 WTM和sod-1 A4VM动物暴露于E. coli或E. faecium。先天免疫基因以E. faecium依赖的方式持续下调，而氧化还原酶活性基因上调。qRT-PCR结果证实了RNA-seq的发现，显示了正相关，并强化了E. faecium特异性驱动这些基因表达变化。
由于先天免疫反应簇是E. faecium暴露最强烈下调的簇之一，我们假设经典免疫通路的激活可能有助于运动神经元退行性变，而它们的抑制可能具有保护作用。为了测试这一点，我们使用RNAi敲低经典免疫通路，包括PMK-1、DAF-16、ELT-2和SKN-1，在存在和不存在E. faecium的情况下对经受百草枯诱导氧化应激的动物进行实验。由于通过喂食进行RNAi在大多数神经元中基本无效，这些实验主要反映了这些基因在肠道和其他非神经元组织中的作用。pmk-1、daf-16、elt-2或skn-1的RNAi并未阻止喂食E. coli的动物的运动神经元退行性变，并且没有改变E. faecium处理的神经保护效应，表明这些经典免疫通路的调节不是氧化应激下神经保护的决定性因素。
Cytochrome P450 genes protect against motor neuron degeneration during oxidative stress
我们对E. faecium处理动物的转录组分析揭示了氧化还原酶基因的强烈富集，表明这些基因可能在神经保护中发挥作用。值得注意的是，氧化还原酶活性簇中的23个基因中有10个属于细胞色素P450（CYP）家族，这是一组先前与神经退行性过程相关的基因。qRT-PCR分析证实，多个cyp基因，包括cyp-35A3、cyp-35A1、cyp-35C1、cpy-33C8、cpy-34A9、cyp-35D1、cpy-13A7、cpy-33C9、cyp-35A5和cyp-13A5，在sod-1 WTM和sod-1 A4VM动物暴露于E. faecium时上调。
一些CYP酶有助于ROS生成，而其他CYP酶则有助于防御氧化应激。为了测试CYPs是否是E. faecium介导的神经保护所必需的，我们敲低了几个受E. faecium上调的cyp基因。由于序列相似性和冗余性，cyp-35A12345可以通过混合RNAi敲低，该RNAi靶向所有五个基因。敲低cyp-35A12345降低了E. faecium介导的对运动神经元退行性变的保护。我们还检测了cyp-35A12345敲低后动物的存活和运动，发现抑制cyp-35A12345也降低了E. faecium暴露赋予的动物存活和运动保护。
为了探索CYP介导的氧化应激期间神经保护的机制，我们使用荧光探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）测量了细胞内ROS水平。喂食E. coli然后进行百草枯处理的动物显示出高ROS水平，而E. faecium处理的动物在暴露于百草枯时显示出低ROS水平。敲低cyp-35A12345降低了E. faecium暴露赋予的ROS水平降低。总之，这些结果表明CYPs是E. faecium介导的神经保护所必需的，并且至少部分地通过减少氧化应激期间的细胞内ROS水平来发挥作用。
NHR-86 is required in E. faecium-mediated neuroprotection
CYP酶是异生物质代谢的核心，在哺乳动物和秀丽隐杆线虫中受到NHRs的严格调节。响应异生物质暴露，NHRs作为转录因子激活编码代谢酶和多药外排泵组分的基因。为了确定NHRs是否介导E. faecium诱导的cyp基因表达，我们首先鉴定了参与此调节通路的候选nhr基因。
先前的转录组研究发现，在暴露于基因毒性化合物的秀丽隐杆线虫中，cyp和nhr基因均上调，表明这些基因家族的协调调节。我们使用cyp-35A1、cyp-35A3和cyp-35A5作为转录读数，对负责调节cyp基因的13个nhr基因（nhr-62, nhr-130, nhr-201, nhr-203, nhr-237, nhr-86, nhr-207, nhr-235, nhr-11, nhr-12, nhr-106, nhr-196, 和 nhr-205）进行了候选突变体筛选。在野生型动物中，E. faecium处理导致cyp-35A1表达的稳健诱导。这种诱导被靶向nhr-203或nhr-86的RNAi显著降低，表明两种核受体都有助于cyp-35A1的调节。相反，cyp-35A3和cyp-35A5响应E. faecium的表达仅依赖于nhr-86，因为它们的mRNA水平不受nhr-203敲低的影响。
我们接下来测试了nhr-86或nhr-203是否是E. faecium介导的神经保护所必需的。敲低nhr-86，而不是nhr-203，损害了E. faecium介导的对运动神经元退行性变的保护，并降低了ROS水平的抑制。这些发现得到了大颗粒流式细胞术的进一步支持，该技术显示E. faecium诱导的细胞内ROS减少依赖于nhr-86，而不依赖于nhr-203。此外，nhr-86敲低消除了E. faecium对氧化应激诱导的运动和存活的保护作用。总之，这些数据表明nhr-86，而不是nhr-203，对于E. faecium介导的神经保护至关重要，并在CYP基因激活的上游发挥作用，而nhr-86表达本身不受E. faecium调节，如RNA-seq和qRT-PCR所示。
为了进一步评估NHR-86在E. faecium激活的转录程序中的作用，我们将E. faecium调节的转录组与已发表的NHR-86 ChIP-seq数据集进行了比较。该分析揭示了E. faecium诱导基因与NHR-86结合靶点之间的重叠，包括CYP基因如cyp-35A1和cyp-35A5，以及许多其他基因。这些发现表明NHR-86是介导宿主对E. faecium反应的几个转录效应因子之一。
为了确认nhr-86是此保护通路所必需的，我们测试了在其内源性启动子下表达nhr-86是否可以挽救sod-1 A4VM动物中降低的神经保护。这些动物是通过将nhr-86(tm2590);nhr-86p::nhr-86动物与sod-1 A4VM动物杂交产生的。NHR-86的表达完全恢复了E. faecium介导的对sod-1 A4VM动物中胆碱能运动神经元退行性变的保护，并挽救了sod-1 A4VM;nhr-86(tm2590)动物中暴露于E. faecium时cyp-35A1、cyp-35A3和cyp-35A5的mRNA水平，并恢复了E. faecium对动物存活和运动的保护作用。这些结果表明，在其自身启动子下表达nhr-86足以重新建立CYP激活并赋予响应E. faecium的神经保护。值得注意的是，单独过表达NHR-86在E. coli饮食上并未赋予神经保护或诱导cyp表达，表明NHR-86激活依赖于E. faecium提供的特定信号。
The intestinal function of NHR-86 is required in E. faecium-mediated neuroprotection
NHR-86在神经元、肠道和皮下组织中表达；然而，由于其调节的CYP基因主要是肠道的，并且神经退行性变发生在神经元中，我们专注于其神经元和肠道作用。
为了确定神经元NHR-86功能是否是氧化应激期间神经保护所必需的，我们在sod-1 A4VM动物中进行了神经元特异性敲低nhr-86。我们通过将sod-1 A4VM动物与神经元特异性RNAi品系MAH677杂交，生成了神经元特异性RNAi ALS模型。nhr-86的神经元特异性敲低对E. faecium介导的神经
