《PLOS Genetics》：The regenerative period of somatosensory nerves is closed by a DCC signaling axis
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本研究发现斑马鱼中枢投射背根神经节（DRG）轴突的再生能力在发育早期（2-3 dpf）迅速关闭，并揭示其机制与Netrin1b表达胶质细胞的背侧重组激活DCC-cAMP-Rac1信号轴、进而抑制生长锥侵袭伪足（invadopodia）稳定性密切相关。通过遗传学（dcc+/-）和药理学（rp-cAMP, NSC23766）手段拮抗该通路可重新开放再生窗口，恢复轴突对脊髓的再侵入及感觉环路功能，为理解发育中再生能力衰退的主动抑制机制提供了新模型。
Centrally-projecting DRG axons in zebrafish exhibit regenerative period closure
为了建立研究再生窗口期遗传机制的模型，研究团队首先确定了发育中的斑马鱼是否表现出随年龄增长而降低的再生能力。他们研究了中枢投射的背根神经节（DRG）轴突的再生能力，因为其在哺乳动物中已确立的再生窗口期以及与人类臂丛神经损伤的临床相关性。通过使用Tg(ngn1:GFP);Tg(gfap:NTR-mCherry)动物可视化DRG及其中枢轴突束，并利用已发布的正交位移量化分析方案，研究团队在2、3和5天受精后（dpf）对单个DRG的中枢轴突束进行轴突切断术，并在损伤后24小时（hpi）重新成像以确定再生窗口期何时关闭。结果表明，在2 dpf受伤的轴突有80%成功再生进入脊髓，而在3 dpf受伤的轴突仅有10%再生，5 dpf受伤的轴突则未检测到再生。这些数据表明斑马鱼中枢投射DRG轴突经历了一个在2至3 dpf之间的24小时内迅速关闭的再生窗口期，从而确立了斑马鱼作为研究再生窗口期关闭机制的模型。
Glial cells re-organize during regenerative period closure
为了确定关闭再生窗口期的细胞机制，研究团队首先探究了2 dpf和3 dpf之间组织结构是否发生变化。通过使用Tg(ngn1:GFP);Tg(sox10:nls-Eos)动物可视化DRG神经元和中枢投射轴突，并对DRG周围的sox10+胶质细胞核进行光转换，在轴突切断术后的延时成像中，量化了轴突（基于生长锥位置）和DRG胞体周围最背侧胶质细胞核的迁移距离。结果显示，与2 dpf动物相比，3 dpf动物的胶质细胞核持续定位在更靠近DRG背侧的位置，并且在轴突重新开始延伸后的140个时间点内，胶质细胞核持续向背侧迁移。相比之下，2 dpf动物的胶质细胞核平均位置更靠近DRG。 mock损伤实验表明，这种胶质细胞重组是固有的发育过程的一部分，而非轴突损伤本身所致。更重要的是，在3 dpf动物中进行中枢轴突轴突切断术前，先消融邻近/背侧的胶质细胞核，可显著提高中枢轴突的再生率（33.33%），而未进行胶质细胞消融的对照组再生率仅为11.11%。 mock消融对照组则无此效应。这些结果支持了围绕DRG的胶质细胞在3 dpf动物中发生重组，参与关闭中枢投射DRG轴突再生窗口期的假说。
netrin1b increases in glial cells dorsal to DRG during regenerative period closure
为了识别调节再生窗口期关闭的分子机制，研究团队搜索了在DRG神经元周围胶质细胞中表达的转录本。通过杂交链式反应（HCR）检测DCC配体Netrin-1，意外地发现netrin1b在DRG神经元周围的细胞中富集。定量分析显示，与2 dpf相比，3 dpf时DRG神经元背侧的netrin1b表达增加，这与胶质细胞重组和再生窗口期关闭同时发生。相比之下，脊髓底板中的netrin1b表达在2 dpf和3 dpf动物之间没有差异。在损伤背景下，3 dpf动物损伤后10小时，DRG背侧netrin1b的高表达水平得以维持，而2 dpf动物损伤后4小时表达水平仍然较低。这些数据表明，当3 dpf动物的再生窗口期关闭时，再生轴突路径上的netrin1b可用性更高。通过在3 dpf动物中消融一个DRG周围的sox10+细胞核，证实胶质细胞是这种netrin1b强表达的原因。同时，对dcc转录本的HCR分析显示，在2 dpf和3 dpf动物之间，DRG神经元中的dcc表达没有统计学差异，但在损伤背景下，特别是在经历了中枢轴突轴突切断术的DRG中，3 dpf动物损伤后10小时神经元dcc表达显著增加。这些发现支持了一个模型，即dcc和netrin1b在组织中以时空特异性的方式组织起来，在3 dpf时关闭再生窗口期。细胞特异性过表达dcc的实验排除了dcc上调本身足以关闭再生窗口期的假说，从而引导研究团队测试限制DCC信号是否可以重新开放3 dpf动物中已关闭的再生窗口期。
Antagonizing DCC-cAMP-Rac1 signaling re-opens the regenerative period
为了确定DCC信号轴是否是3 dpf时关闭DRG中枢轴突再生窗口期的遗传机制的一部分，研究团队靶向了DCC-cAMP-Rac1信号过程的每一步并评估再生效果。在3 dpf对Tg(ngn1:GFP);Tg(gfap:NTR-mCherry)动物进行单DRG中枢轴突切断术后，使用遗传或分子手段操纵DCC-cAMP-Rac1信号过程24小时，然后在24 hpi时通过正交位移量化评估再生情况。结果显示，与仅用载体对照（1% DMSO）处理的野生型动物（0%再生）相比，dcc杂合突变体（dcc+/-）、cAMP拮抗剂类似物rp-cAMP（25 μM）或Rac1抑制剂NSC23766（1 μM）处理分别使55%、50%和55%的轴突再生进入中枢神经系统。双分子操纵和遗传上位性分析表明，cAMP和Rac1在同一分子通路中发挥作用，且该通路调节再生窗口期的顺序为DCC-cAMP-Rac1。重要的是，在再生窗口期完全关闭的5 dpf动物中，联合使用rp-cAMP和NSC23766处理仍能重新开放再生窗口，促进30%的中枢轴突再生，而DMSO对照组为0%。免疫组织化学分析显示，DCC突变或rp-cAMP或NSC23766处理并不影响胶质细胞的重组，表明DCC-cAMP-Rac1通路并非通过改变胶质组织来调节再生窗口期。这些数据表明，DCC-cAMP-Rac1信号通路以DCC-cAMP-Rac1的顺序关闭再生窗口期，拮抗性地靶向该信号通路可以重新开放该窗口期并促进再生。
Antagonizing the DCC-cAMP-Rac1 signaling pathway increases invadopodia stability
中枢投射的DRG轴突必须导航回到背根入口区（DREZ）才能再生，在此过程中，丝状伪足（filopodia）是引导其迁移的主要生长锥结构。一旦到达DREZ，穿过脊髓边界的侵入需要称为侵袭伪足（invadopodia）的特化肌动蛋白基生长锥结构，其标志是强大的肌动蛋白积累和正交基底突起。DCC-cAMP-Rac1信号通路已被证明在先锋中枢轴突发育过程中时空限制侵袭伪足的形成，直到生长锥到达DREZ才需要稳定的侵袭伪足组装以侵入中枢神经系统。基于胶质细胞重组和DRG背侧netrin呈现增加与再生窗口期关闭相关的观察，研究团队假设再生窗口期关闭是因为DCC-cAMP-Rac1信号阻止了稳定侵袭伪足的形成。为了确定DCC信号关闭再生窗口期的潜在机制，研究团队在Tg(sox10:Gal4 + myl7:GFP);(UAS:LifeAct-GFP)动物中操纵通路中的每个分子并评估侵袭伪足。通过量化再生生长锥中心肌动蛋白的荧光强度来表征侵袭伪足的稳定性。结果显示，减少DCC（dcc+/-动物）、拮抗cAMP（rp-cAMP）和抑制Rac1（NSC23766）都显著增加了侵袭伪足在DREZ的稳定性（平均持续时间延长），而cAMP激动剂sp-cAMP则重现了野生类型的瞬时侵袭伪足。联合处理和遗传上位性分析证实，侵袭伪足稳定性受该信号通路以DCC-cAMP-Rac1的顺序调节。形态学观察和皮质蛋白（Cortactin）免疫染色进一步证实了稳定侵袭伪足结构的形成。这些数据支持了DCC信号通过主动降低侵袭伪足形成的稳定性来关闭再生窗口期的假说。
Cell-specific manipulation of DCC and Rac1 alter invadopodia stability
基于dcc和netrin的HCR表达分析，研究团队接下来假设DCC信号在DRG中自主发挥作用。为了验证这一点，他们首先通过向Tg(sox10:Gal4 + myl7:GFP);(UAS:LifeAct-GFP); dcc+/-胚胎单细胞期注射UAS:dcc-tdTomato，在DRG细胞中特异性增加dcc表达。实验表明，在dcc+/-动物中，DRG表达DCC-tdTomato会降低侵袭伪足的稳定性，使其在DREZ的持续时间恢复到野生型水平，这表明DCC在DRG细胞中特异性发挥作用以 destabilize 侵袭伪足。同时，在表达DCC-tdTomato的dcc+/-动物中，更多的再生轴突随后发生回缩，表明再生潜力降低。而用rp-cAMP处理这些动物则可以逆转DCC过表达带来的负面影响，增加侵袭伪足稳定性并提高轴突停留在DREZ的比例。为了测试Rac1是否在DRG中特异性控制再生窗口期，研究团队注射了光激活Rac1构建体（UAS:pa-Rac1-mCherry）。实验发现，在rp-cAMP处理背景下，光激活pa-Rac1（暴露于445 nm光）可逆转rp-cAMP诱导的侵袭伪足稳定性，使其 destabilize，并相应地降低再生潜力（轴突回缩率增加）。这些数据支持了Rac1在DRG细胞中自主发挥作用以降低侵袭伪足稳定性，从而阻碍再生潜力的模型。
Opening the regenerative period by antagonizing DCC signaling restores somatosensory circuits
再生窗口期的关闭阻止了损伤后DRG与脊髓之间体感环路的功能恢复。为了确定通过操纵DCC信号重新开放再生窗口期是否能恢复体感环路，研究团队利用在DRG和脊髓神经元中表达的基因编码钙指示剂GCaMP6s的活动作为感觉刺激下神经元活动的代理。通过对3 dpf的Tg(NeuroD:Gal4 + myl7-GFP);(UAS:GCaMP6s)和Tg(sox10:mRFP)动物进行连续8个DRG（#4–11）轴突切断术，然后进行24小时的DCC-cAMP-Rac1通路操纵处理，再无处理恢复24小时，在损伤后48小时进行钙成像分析。结果显示，在未受伤动物中，平均97.78%的脊髓神经元表现出与DRG活动快速同步的活动。然而，受伤的DMSO载体对照和未处理对照组动物，这种同步性显著降低。相比之下，经过拮抗性操纵的组别（dcc+/-、rp-cAMP处理、NSC23766处理）则显示出更高比例的脊髓神经元与先前受伤的DRG活动同步，与未受伤对照组无显著差异。这些数据与重新开放中枢投射DRG轴突的再生窗口期能够恢复体感环路的观点一致。
Opening the regenerative period recovers somatosensory-induced behaviors
体感环路的功能恢复在损伤后也应能恢复行为反应。当暴露于冷水（4°C）时，斑马鱼幼鱼表现出由头部和尾部运动组成的颤抖行为，而不向前游动。这种表型取决于斑马鱼在再生和发育背景下完整的DRG环路。研究团队对3 dpf的Tg(ngn1:GFP);Tg(gfap:NTR-mCherry)动物进行连续轴突切断术和24小时的处理，然后无处理恢复24小时。在损伤后48小时，重新成像评估8个受伤中枢轴突的再生率，然后进行行为学分析。结果显示，未受伤对照在约50%的帧数中表现出颤抖行为。然而，在损伤后48小时，受伤的DMSO处理对照组动物平均仅在28.18%的帧数中颤抖，其中枢轴突再生率约为25%。类似地，激动剂处理组（sp-cAMP等）也显示出减少的颤抖时间和较低的再生率。与此形成鲜明对比的是，拮抗性操纵组（dcc+/-、rp-cAMP、NSC23766等）不仅显示出更高的中枢轴突再生率（约45-55%），而且其颤抖时间也显著延长，接近甚至达到未受伤对照水平。对游泳能力的分析排除了颤抖行为是由于无法游动所致。这些结果表明，拮抗性操纵DCC-cAMP-Rac1信号可以重新开放再生窗口期，增强DRG中枢轴突再生，并相应地恢复体感诱导的行为，表明先前轴突切断的DRG与中枢神经系统之间的感觉环路功能再生得到改善。
Discussion
再生窗口期关闭是发育的一个重要组成部分，它确保了组织的正常功能结构，并保护机体免受异常细胞生长的侵害。然而，在损伤和疾病状态下，这会使组织可塑性和再生能力下降，可能导致永久性或长期功能障碍。本研究强调了一种动态相互作用：胶质细胞重组、导向因子空间分布以及生长锥细胞骨架动力学调节，共同调控发育过程中的一个再生窗口期。研究数据支持了再生能力并非丧失而是被主动抑制的观点，为重新开放再生窗口期和促进损伤后功能恢复提供了有前景的分子靶点。
