蚕豆蛋白苦味异味的分子解析：巢菜碱、伴巢菜碱及其新型衍生物的关键作用

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Contribution of Vicine, Convicine, and New Derivatives to the Bitter Off-Taste of Fava Bean Proteins

本综述通过活性引导分馏技术系统鉴定蚕豆蛋白中关键苦味物质，结合UHPLC–ToF-MS/NMR结构解析、细胞苦味受体（TAS2R）激活实验及剂量-阈值（DoT）因子计算，首次揭示巢菜碱（vicine）与伴巢菜碱（convicine）分别通过激活TAS2R16/TAS2R43受体引发苦味，并发现8种新型衍生物。研究为蚕豆蛋白的苦味调控及植物基食品开发提供分子靶点。

　　

引言

世界卫生组织（WHO）2021年宣言指出，植物性饮食可降低心血管疾病、癌症等非传染性疾病风险。蚕豆作为欧洲第二大豆类作物，其蛋白具有高生物价（PDCAAS值86.5%），但苦味异味严重限制其食品化应用。先前研究表明，豌豆、油菜籽蛋白的苦味与脂肪酸氧化产物及蛋白结合态代谢物相关，但蚕豆蛋白苦味成分的系统解析尚属空白。

材料与方法

样品处理与分馏

研究选取9种工业蚕豆蛋白样品（蛋白含量55–85%），通过顺序溶剂提取（甲醇-水、甲醇、乙酸乙酯、正戊烷）获得4种提取物。感官评价确定甲醇-水提取物（Extract 1）苦味最强（评分3.0/5），进而通过制备型RP-HPLC将其分为13个馏分（F1–F13）。滋味稀释分析（TDA）显示F5、F9、F11的TD值最高（24–32），选定为关键苦味馏分进行后续分离。

化合物鉴定与结构解析

采用UHPLC–ToF-MS和1D/2D NMR技术，从F5馏分中鉴定出3种已知苦味物质：巢菜碱（1，C₁₀H₁₆N₄O₇）、伴巢菜碱（2，C₁₀H₁₅N₃O₈）和3′-O-β-d-葡萄糖基-L-多巴（11）。其中11的NMR数据为首次完整报道（¹H NMR: δ 4.70 ppm, J=7.5 Hz, H-C(1′)）。

此外，发现8种新型巢菜碱/伴巢菜碱衍生物：

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  二糖衍生物：如巢菜碱-5-O-(6′→1″)-β-d-二葡萄糖苷（7）和异乌拉米尔-5-O-(3′→1″)-β-d-二葡萄糖苷（9），通过HMBC谱中H-C(1″)与C(6′)或C(3′)的相关性确认糖苷键连接；
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  糖基化酯类：如巢菜碱-6-O-异戊酸酯（3）和伴巢菜碱-6-O-异戊酸酯（4），其异戊酸基团通过酯键与葡萄糖C(6′)连接（HMBC: H-C(6′)与C(8′)相关）；
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  羟基脂肪酸酯：如(2E,4E)-8-羟基-2,7-二甲基-2,4-癸二烯-1,10-二酸-6-O-巢菜碱酯（5，HDDD-巢菜碱），其双羧酸结构通过¹³C NMR中C(1″)=167.7 ppm和C(10″)=174.6 ppm确认。

苦味阈值与感官分析

通过二选一强迫选择法（2-AFC）测定苦味阈值：伴巢菜碱（2）阈值最低（0.18 mmol/L），巢菜碱（1）为1.44 mmol/L。值得注意的是，50%受试者对巢菜碱不敏感（“非尝味者”），但其衍生物（如3）可被全体感知，提示结构修饰可能激活额外苦味受体。

细胞受体激活实验

利用稳定转染TAS2R的HEK 293T-Gα16gust44细胞模型发现：

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  巢菜碱（300 μM–10 mM）激活TAS2R16，与既往研究一致；
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  伴巢菜碱（300 μM）特异性激活TAS2R43，此结果为首次报道；
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  异戊酸酯衍生物因高浓度细胞毒性未能获得剂量曲线。

定量分析与DoT因子评估

通过UHPLC-MS/MS定量9种蛋白样品中苦味物质浓度，计算剂量-阈值（DoT）因子：

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  伴巢菜碱DoT值最高（55–233），为关键苦味贡献者；
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  脂肪酸中亚油酸（linoleic acid）DoT=3.7，直接参与苦味形成；
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  氧化脂质（如9-HODE）浓度低，主要通过协同效应增强苦味。

结论

本研究通过感官组学策略系统解析蚕豆蛋白苦味成分，首次明确伴巢菜碱为核心苦味物质（DoT>230），并发现其通过TAS2R43介导苦味感知。新型衍生物及脂肪酸的协同作用进一步加剧苦味。成果为蚕豆蛋白的脱苦工艺改良及低苦味品种选育提供精准靶点，推动植物蛋白资源的高值化利用。