《Frontiers in Endocrinology》：Testosterone plus lifestyle therapy improves skeletal muscle glycolysis in older men with obesity and hypogonadism
Introduction
肥胖是一个影响数百万成年人的主要全球健康问题，在老年人群中患病率尤其高。随着老年人群肥胖率的持续上升，它导致了衰弱、肌肉减少症和骨质疏松等合并症的负担不断加重，所有这些都 adversely 影响生活质量并增加医疗成本。这些与年龄相关的身体功能下降，又因合成代谢激素水平降低而进一步加剧，特别是睾酮。在健康衰老的男性中，总睾酮水平通常降至成人参考范围的低值（约12–35 nmol/L），而在肥胖相关的功能性性腺功能减退症中，水平常低于10.4 nmol/L。睾酮对于维持男性的肌肉质量、力量和骨矿物质密度（BMD）至关重要，同时它还调节支持能量稳态的代谢途径——包括糖酵解、磷酸戊糖途径和肉碱依赖性脂肪酸转运。当睾酮水平随年龄下降并被肥胖进一步抑制时，这些代谢过程变得失调，导致代谢不灵活以及对肌肉和骨骼流失的易感性增加。代谢组学研究已证明，低睾酮会损害糖酵解、磷酸戊糖途径（PPP）和肉碱代谢，这凸显了需要能够恢复老年肥胖男性合成代谢信号和代谢抵抗力的干预措施。
生活方式疗法（LT），包括热量限制（CR）和体育活动（PA），仍然是管理肥胖的基础策略，能带来体重减轻以及身体和心脏代谢功能的改善。然而，单用LT可能不足以在患有肥胖的老年人中保持肌肉质量和力量，尤其是在存在性腺功能减退的情况下。低睾酮会减弱维持骨骼肌和骨骼所需的合成代谢信号，使得睾酮缺乏成为该人群肌肉骨骼健康受损的重要因素。将睾酮替代疗法（TRT）与LT相结合，为对抗肥胖和衰老的分解代谢效应提供了一种有前景的方法。
老年肥胖者生活方式干预和睾酮替代（LITROS）试验旨在测试TRT是否能增强LT对肥胖伴性腺功能减退老年男性身体功能的影响。在主试验中，身体性能测试（PPT）评分在LT加TRT和LT加安慰剂组间改善相似，而峰值摄氧量（VO2peak）在TRT组增加更多。TRT还有助于在减重期间保持瘦体重和髋部BMD。随后的分析报告对心脏代谢结局没有额外益处，而转录组学分析表明，TRT阻止了LT诱导的对肌肉和骨骼合成代谢关键基因的下调，并减弱了LT相关的骨骼肌代谢通路的下调，提示更广泛的代谢功能得以保留。
这些发现为当前的肌肉代谢组学子研究提供了理论依据。本研究调查了在LT基础上加用TRT是否会改变骨骼肌代谢组，重点关注调节能量产生和底物利用的途径。具体来说，我们分析了糖酵解、PPP、肉碱代谢和三羧酸（TCA）循环，以确定途径水平的适应在肥胖伴性腺功能减退的老年男性中，LT联合TRT与LT联合安慰剂之间是否存在差异。
Methods
研究设计和参与者
本报告是LITROS试验的一项预设子研究，侧重于骨骼肌代谢组学，并总结了选定的临床结局以描述子研究队列的特征。
在母试验随机分组的83名男性中，有55人同意参加代谢组学子研究并接受了肌肉活检。其中28人被分配到生活方式疗法加睾酮替代疗法（LT+TRT）组，27人被分配到生活方式疗法加安慰剂（LT+Pbo）组。在考虑了退出研究和拒绝重复活检的参与者后，每组各有22人提供了适合代谢组学分析的配对基线和6个月肌肉样本。
该研究在德克萨斯州休斯顿的Michael E. DeBakey退伍军人事务医疗中心进行。参与者为年龄≥65岁、患有肥胖（BMI ≥30 kg/m2）、确诊性腺功能减退（两次晨起空腹总睾酮水平<10.4 nmol/L）和轻度至中度衰弱（PPT评分18-31）的男性。符合资格标准的参与者按BMI进行区组随机化。
干预措施
LT包括结构化饮食和监督锻炼。饮食目标是每日产生500–750 kcal的热量缺口，每周进行小组会议以进行调整、行为咨询和审查食物日记。锻炼每周三次，每次90分钟，结合有氧、抗阻和平衡训练。有氧训练从约65%的峰值心率开始，逐渐增加到75–85%。抗阻训练针对上下肢肌肉，使用举重设备，以65%的一次重复最大重量（1-RM）进行1–2组，每组8–12次重复，并逐渐增加到约85% 1-RM的2–3组。总体目标是在6个月内减重约10%。
TRT包括每天早晨局部涂抹一次经皮睾酮凝胶（Androgel 1.62%）。初始剂量（40.5 mg/天）根据标准给药指南选择，并滴定以使血清睾酮浓度达到生理范围。为维持盲法，LT+Pbo组参与者接受相同的程序和同步的假剂量调整。
身体功能和身体成分
使用PPT评估衰弱情况，PPT是九项功能任务的综合评分。肌肉力量通过1-RM测试测量。峰值摄氧量（VO2peak）在分级跑步机行走期间使用代谢测量系统进行评估。
通过双能X线吸收测定法（DXA）测量身体成分和BMD。使用MRI评估大腿肌肉体积。
激素和代谢功能
在基线和干预6个月后收集晨起空腹血样。使用经过验证的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法测量血清总睾酮。通过平衡透析法测量游离睾酮。使用代谢综合征的组成部分评估心脏代谢风险因素，包括空腹血糖、甘油三酯、高密度脂蛋白（HDL）胆固醇、收缩压和舒张压以及腰围。根据这五个组成部分计算代谢综合征评分，分数越高表示代谢功能障碍越严重。
肌肉活检
使用Tilley-Henkel钳从股外侧肌获取肌肉活检组织。活检后，标本立即清除血液和脂肪组织，在液氮中速冻，并储存用于批量代谢组学分析。干预结束时的活检在禁食过夜后至少48–72小时且最后一次监督锻炼后进行，以尽量减少急性运动效应。
代谢组学分析
骨骼肌代谢组学分析在贝勒医学院代谢组学核心设施进行。靶向面板包括来自糖酵解、PPP、肉碱代谢和TCA循环的代谢物。约20 mg冷冻骨骼肌在含有等摩尔混合的同位素标记内标的甲醇中匀浆。匀浆液进行双相溶剂萃取。含有极性代谢物的水相被分离，使用3 kDa分子量截留过滤器过滤，并在真空下干燥。
使用液相色谱-三重四极杆质谱（LC-QQQ）以单反应监测（SRM）模式进行质谱分析。为每个代谢物类别优化了离子对。为确保重现性，所有样品均添加了同位素标记的内标，并定期注入混合质控（QC）肌肉提取物以监测仪器性能。
统计分析
使用独立t检验或Fisher精确检验比较组间基线特征。使用重复测量ANCOVA分析激素、身体成分、身体和代谢功能以及代谢物浓度的纵向变化，并将基线值作为协变量输入。对于代谢物浓度，在分析前对数据进行对数转换以满足正态性和方差齐性假设。
采用主成分分析（PCA）来降低维度并总结每个代谢域内代谢物的变异。对于每个代谢途径，因子得分代表从载荷≥0.5的代谢物推导出的标准化第一主成分。计算PCA推导的因子得分（糖酵解、PPP、肉碱和TCA循环）的变化分数，作为6个月值与基线值的差值，并根据基线进行调整，然后标准化。
代谢组学的主要分析侧重于PCA推导的因子得分变化的组间差异，这是试验的预设次要结局。未对多重比较进行调整。还进行了单个代谢物的探索性分析以说明每个途径内的模式。
使用Pearson相关系数（r）评估代谢域变化与临床结局变化之间的关联。
Results
干预对临床、功能和代谢结局的影响
基线特征（包括人口统计学和BMI）在组间均衡。正如预期的那样，TRT比安慰剂产生了更大的总睾酮和游离睾酮增加。尽管两组体重减轻相当，但LT+TRT在更大程度上保留了肌肉质量和髋部BMD，表明TRT有助于减轻减重期间的分解代谢效应。身体功能结局总体改善，TRT组的VO2peak增加更多，提示对有氧能力有适度的附加效应，而其他身体功能指标（PPT、步速和1-RM力量）在两组中改善相似。两组甘油三酯水平下降，代谢综合征评分改善，反映了干预整体有利的代谢效应。
LT+TRT与LT+Pbo在关键途径上的差异代谢物变化
首先检查了主要代谢途径中的单个代谢物。在糖酵解中，与LT+Pbo相比，LT+TRT与G6P/F6P、FBP/GBP、甘油醛-3-磷酸、PEP和乳酸的更大增加相关，而3PG/2PG、丙酮酸和甘油-3-磷酸未见差异。在PPP中，LT+TRT组的赤藓糖-4P显著高于LT+Pbo组，而其他代谢物未变。在肉碱代谢中，LT+TRT组的丙酰肉碱显著升高，其他酰基肉碱无组间差异。在TCA循环中，未检测到显著的代谢物差异。
主成分分析
为了降低维度并捕捉每个代谢途径内的协调变异，进行了PCA。糖酵解、磷酸戊糖、肉碱和TCA代谢的第一主成分的特征值分别为3.87、2.49、7.69和2.74，分别解释了55.2%、41.5%、35.0%和34.3%的方差。在糖酵解中，该成分最强地由甘油醛-3-磷酸和乳酸代表。磷酸戊糖成分主要由6-磷酸葡萄糖酸和赤藓糖-4P驱动。肉碱代谢的特征是丁酰肉碱、辛酰肉碱和异丁酰肉碱。TCA循环成分主要由顺乌头酸和苹果酸主导，富马酸和柠檬酸的贡献较小。
与LT+Pbo相比，LT+TRT增加了糖酵解因子评分
使用PCA推导的因子得分评估代谢途径的纵向变化。在糖酵解中，LT+TRT组的因子得分比LT+Pbo组显著增加。两组表现出相反的趋势：LT+TRT组的糖酵解活性增加，而LT+Pbo组则下降。在PPP中，LT+TRT组观察到不显著的上行趋势，而LT+Pbo组的得分保持不变。在肉碱代谢和TCA循环中，两组的因子得分均保持稳定，无显著组间差异。
糖酵解与功能和代谢结局的关联
相关性分析将糖酵解因子得分的变化与功能和代谢结局联系起来。在LT+TRT组中，糖酵解因子得分的增加与VO2peak的改善呈正相关。相反，糖酵解因子得分的变化与甘油三酯水平呈负相关，与代谢综合征评分也呈负相关。未观察到与肌肉质量、肌肉力量或BMD的显著相关性。在LT+Pbo组中，未检测到显著关联。
Discussion
LITROS肌肉代谢组学子研究旨在探索我们先前LITROS试验的代谢机制，该试验证明在肥胖伴性腺功能减退的老年男性减重期间，TRT联合LT减轻了肌肉和骨骼质量的损失。在所检查的途径中，糖酵解成为LT+TRT的主要且一致的代谢特征，突显了在LT+Pbo中未观察到的独特分子适应。
这一观察值得注意，因为糖酵解代表了一个基本的能量产生途径，不仅能快速产生ATP，还能为生物合成和氧化过程提供关键中间体。本研究中的糖酵解因子得分来源于循环代谢物浓度而非基因表达，它反映了糖酵解相关代谢物的协调变化。在患有肥胖和性腺功能减退的老年男性中，代谢灵活性受损，表现为响应能量需求在脂肪酸和葡萄糖氧化之间切换的能力降低。我们的结果表明，TRT部分通过改善糖酵解来恢复这种能力，从而抵消了安慰剂组中观察到的下降。在LT+Pbo组，糖酵解因子得分下降，表明向更大程度依赖氧化代谢的转变。虽然这可能反映了氧化效率的改善，但也代表了糖酵解能力的丧失，这可能会损害在能量应激期间产生快速ATP和合成代谢中间体的能力。相比之下，TRT增加了糖酵解，为其提供了必要的能量和合成代谢支持，以在减重期间维持瘦组织（包括肌肉和骨骼质量）以及功能能力。
从机制上讲，这种LT+TRT诱导的代谢重编程的特征是糖酵解预备阶段（能量投入）和收益阶段（能量产生）中间体的协调升高，这被解释为与糖酵解通量增强和向丙酮酸还原为乳酸转变相一致。这种代谢模式在能量需求条件下提供ATP，并可能有助于改善运动表现。重要的是，糖酵解中间体如葡萄糖-6-磷酸和3-磷酸甘油酸也可以供给辅助合成代谢途径，包括PPP和丝氨酸生物合成。尽管这些途径在我们的数据集中没有显示出一致的长期重编程，但它们可能被急性激活的潜力强调了改善糖酵解在支持恢复力方面的多方面作用。
在临床上，这些分子适应与有意义的结局相关。在LT+TRT组内，糖酵解因子得分的较高增加与VO2peak的更大改善、甘油三酯水平的降低以及更低的代谢综合征评分相关，而在LT+Pbo组中未观察到这种关联。这些发现与先前的证据一致，即TRT可能增强有氧能力和心脏代谢健康，并通过提供改善糖酵解重编程的直接肌肉水平证据扩展了这一文献。一个合理的生物学解释是乳酸穿梭；增强的糖酵解增加了乳酸的可用性，乳酸随后被邻近纤维或其他组织中的线粒体氧化，从而将无氧糖酵解与有氧ATP产生耦合起来。这个过程在运动期间支持氧化代谢，因为通过糖酵解产生的乳酸可以作为线粒体呼吸的易氧化底物，使得具有更高糖酵解激活的个体能够维持更高的有氧工作速率。同时，雄激素介导的GLUT4表达和转运的改善可能增强肌肉葡萄糖摄取和全身胰岛素敏感性，有助于降低甘油三酯和整体代谢风险。除了肌肉，保留的糖酵解支持也可能有助于维持骨质量，这与我们之前的表型发现一致，即联合干预在减重期间保持了骨骼完整性。
重要的是，这些代谢组学结果也可能与我们之前在同一队列中的转录组学发现一致。在该子研究中，LT+TRT减弱了在LT+Pbo中观察到的骨骼肌代谢通路的下调，可能包括与葡萄糖利用和糖酵解相关的基因。虽然基因水平的详细对齐仍有待确认，但这种模式提示了一定程度的多组学一致性，转录组学和代谢组学数据都表明在TRT下肌肉葡萄糖代谢得以保留。因此，未来的研究应整合转录组学、代谢组学和蛋白质组学分析，以确定合成代谢干预如何重塑衰老肌肉中的代谢网络。
我们的发现扩展了先前关于性腺功能减退代谢后果的观察。在性腺功能减退男性中的血浆代谢组学研究显示糖酵解通量被抑制、氨基酸衍生的糖异生增强以及更依赖酮体生成。乳酸和乙酰辅酶A的积累，转向酮体生产，反映了一种代谢不灵活的状态，可能损害肌肉功能和全身葡萄糖处理。相比之下，我们目前的结果提供了直接证据，表明TRT可以在肌肉组织水平改善这一轨迹。
本研究的新颖之处在于将机制性代谢组学方法与在衰弱、肥胖伴性腺功能减退的老年男性中精心设计的生活方式干预试验相结合。与先前单独研究CR或运动训练（主要促进氧化适应）或研究TRT单药治疗（主要侧重于身体成分和力量）不同，我们的研究结果显示出独特的协同作用——TRT在联合饮食和运动的背景下特异性增强了糖酵解。这种变化伴随着瘦体重和BMD的保留，并且通过观察到的相关性直接与有氧能力和心脏代谢健康的改善相关。总之，这些数据建立在LITROS早期的临床发现基础上，并为理解合成代谢干预如何与生活方式疗法相互作用提供了新的机制理论基础。
这项工作的一个关键优势是母试验的稳健设计，该试验是随机、双盲的，最大限度地减少了偏倚并增强了有效性。受监督和标准化的LT计划确保了两组的依从性。同时，靶向肌肉代谢组学方法提供了对组织水平重塑的生理相关窗口，而不是仅仅依赖循环标志物。这种基于组织的方法特别有价值，因为它捕获了骨骼肌内的直接效应——骨骼肌是运动适应和葡萄糖处置的主要效应器——这些效应在测量全身代谢物时可能被掩盖。
尽管有这些优势，但必须承认几个局限性。首先，代谢组学子研究的样本量适中，这可能限制了统计功效和普遍性；然而，在多个终点观察到的一致的分子和临床模式有助于减轻这种担忧。此外，由于我们没有应用正式的FDR校正，单个代谢物结果应在我们预设的、以通路为重点的假设背景下谨慎解释。其次，随访时间仅为六个月，这限制了我们确定该人群中代谢转变持久性的能力。第三，伦理考虑阻止了纳入单独的TRT组，这限制了我们确定观察到的效应是反映TRT单独作用还是其与生活方式疗法相互作用的能力。第四，尽管糖酵解及相关中间体的协调变化为途径活性改变提供了强有力的推论证据，但代谢物丰度并不直接量化酶促通量，并且未进行同位素或酶学验证。第五，虽然靶向代谢组学为评估糖酵解、PPP、TCA和肉碱途径提供了精确性，但它也排除了其他潜在相关的代谢物。最后，对TRT的依从性在现实世界中仍然是一个挑战，临床实践中一年内的停药率高达60–70%。尽管这些局限性限制了普遍性，但我们的发现在分子、表型和功能结局上的一致性增强了对其有效性的信心。
这些代谢适应，连同观察到的有氧能力和代谢风险因素的改善，可能对管理老年性腺功能减退男性的代谢和功能衰退具有潜在意义。未来的研究应通过纳入互补的组学方法来扩展这些发现，以加深对睾酮替代和生活方式疗法下代谢调节的理解。需要进行更大规模和更长期的临床试验，以确定这些代谢适应的持久性和临床相关性，包括它们对身体功能、残疾减少和心脏代谢风险的影响。此外，包含单独睾酮组的研究设计可能有助于阐明睾酮独立的代谢贡献。
Conclusion
总之，在肥胖伴性腺功能减退的老年男性中，在LT基础上加用TRT改善了糖酵解，这是在六个月时唯一被一致重编程的代谢途径。这种糖酵解适应与VO2peak的增加、甘油三酯的降低以及更低的代谢综合征评分相关，同时伴随着瘦体重和骨质量的保留。总之，这些发现强调了其机制和临床相关性，表明TRT可能有助于恢复这一高风险人群的代谢灵活性和恢复力。在将这些结果转化为临床实践之前，进行更大规模、更长期和机制整合的研究将是至关重要的。
