基于微滴式数字PCR技术检测猪轮状病毒Vp4基因方法的建立及其应用价值分析

《Frontiers in Veterinary Science》：Establishment of a droplet digital PCR detection method for Vp4 gene of PoRV

本文建立了一种靶向猪轮状病毒（PoRV）Vp4基因的微滴式数字PCR（ddPCR）检测方法，其最低检测限达0.21拷贝/μL，灵敏度较RT-qPCR提升100倍。该方法无需标准曲线即可实现绝对定量，对临床早期感染样本（如RT-qPCR阴性样本）仍能有效检出，为猪病毒性腹泻的精准防控提供了高灵敏度技术支撑。

引言

猪病毒性腹泻是导致仔猪高死亡率的主要原因，对全球养猪业构成严重威胁。猪轮状病毒（PoRV）于1974年首次从猪体内分离，其临床症状包括水样腹泻、呕吐和厌食。PoRV是引起新生仔猪腹泻的肠道病原体，死亡率高达95%。随着日龄增长，猪只抵抗力逐渐增强，成年猪多表现为无症状感染。值得注意的是，PoRV可在猪与人之间传播，对公共卫生安全构成潜在风险。研究显示，PoRV是猪腹泻中第二常见的病毒性病因，样本阳性率达25.81–50.81%，猪场阳性率高达72.77%。

PoRV属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，为无包膜双链RNA病毒，基因组约18,500 bp，包含11个节段编码6种结构蛋白（Vp1–Vp4、Vp6、Vp7）和6种非结构蛋白（NSP1–NSP6）。其中Vp4是病毒外层衣壳蛋白，在感染过程中负责受体结合，并能诱导机体产生中和抗体，是潜在的疫苗免疫原。由于PoRV存在混合感染率高、变异性强等特点，亟需建立快速、精准的检测技术以指导疫病防控。

材料与方法

伦理批准

所有动物实验均经华南农业大学动物伦理委员会批准（批准号2025C024），遵循动物生物医学研究指导原则。

样本检测与优化

研究选取10头2日龄轻度腹泻仔猪的肛拭子样本，胶体金试纸条检测结果为PoRV阴性。为验证结果，采用RT-qPCR复检，发现6份样本为PoRV阳性（Ct值33.02–36.46）。针对RT-qPCR灵敏度不足的问题，研究团队开发了靶向PoRV Vp4基因的ddPCR检测方法。通过优化引物:探针浓度比（400:400 nM）和退火温度（57°C），确定最佳反应体系。ddPCR检测无需标准曲线，通过微滴分割技术将样本分散为数万个独立反应单元，利用泊松算法实现绝对定量。

灵敏度与特异性评估

以pUC57-PoRV-Vp4标准质粒进行梯度稀释（10^?7–10^?12），ddPCR最低检测限为0.21拷贝/μL，而RT-qPCR为2.12×10¹拷贝/μL，灵敏度提高100倍。特异性实验表明，该方法的引物和探针仅对PoRV基因组产生信号，与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流感病毒（SIV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）等常见猪病毒无交叉反应。

结果

临床样本验证

对RT-qPCR检测为阴性的4份肛拭子样本进行ddPCR复测，全部检出PoRV阳性，病毒载量分别为18.7、1.6、2.9和19.1拷贝/μL。进一步对15份临床样本检测发现，6份为PoRV阳性（载量5.8–838拷贝/μL），冬季感染率较高，提示需加强季节性防控。

技术比较

ddPCR在灵敏度与抗干扰性方面显著优于RT-qPCR，尤其适用于低病毒载量样本的早期检测。但其检测耗时约为RT-qPCR的3倍，成本高出2倍，操作复杂度也更高。尽管如此，在种猪净化、引种检疫等场景中，其高灵敏度优势仍具重要应用价值。

讨论

本研究首次建立针对PoRV Vp4基因的ddPCR检测方法，突破传统检测技术的灵敏度瓶颈。Vp4蛋白与人类轮状病毒（HRV）同源性约65%，存在跨种传播风险，因此该方法亦为不同动物轮状病毒的通用检测提供基础。当前针对A群PoRV的检测已实现，未来需扩展至B、C、D、H群毒株的覆盖。

与既往研究对比，本研究检测灵敏度（0.21拷贝/μL）显著高于已报道的RT-qPCR方法（最低6.0×10¹拷贝/μL）。ddPCR的微滴分区技术可有效稀释样本中多糖、血红蛋白等抑制剂，减少假阴性结果，尤其适用于感染窗口期的早期诊断。

结论

本研究建立的ddPCR方法为PoRV感染提供了高灵敏度、高特异性的检测工具，对猪病毒性腹泻的早期预警、流行病学调查及精准防控具有重要意义。该技术策略可推广至其他动物病毒病的监测体系，为养殖业可持续发展提供技术支撑。