NF-κB信号激活组织驻留记忆T细胞促小鼠银屑病复发的机制研究

《Frontiers in Immunology》：Activation of NF-κB signaling in tissue-resident memory T cells promotes recurrent psoriasis in mice

本研究揭示了在咪喹莫特诱导的小鼠复发性银屑病中，经典与非经典NF-κB信号通路的激活通过直接驱动CD8+组织驻留记忆T细胞分化、抑制细胞铜死亡，从而促进疾病复发。研究阐明了CD8+Trm细胞是银屑病复发的关键效应细胞，为靶向Trm细胞及其NF-κB信号通路以预防银屑病复发提供了新的潜在治疗策略。

　　

引言

银屑病是一种慢性、丘疹鳞屑性皮炎，全球超过1.25亿人受其困扰。其根本发病机制涉及先天性与适应性免疫的异常激活和失调。尽管免疫抑制剂和生物疗法在治疗中显示出满意效果，但多数患者仍饱受疾病复发的折磨。揭示其发病机制对于预防复发至关重要。先前病原体的反复刺激或感染是银屑病复发的直接病因，其中由记忆T细胞介导的免疫记忆扮演核心角色。记忆T细胞可分为效应记忆T细胞、中枢记忆T细胞和组织驻留记忆T细胞。与在血液和淋巴器官间循环的Tem/Tcm细胞不同，Trm细胞迁移性低，可在外周组织如皮肤中长期存活。尽管皮肤Trm细胞能对既往病原体感染提供快速的免疫保护，但它们也会在复发性炎症性皮肤病中触发促炎反应。在银屑病中，皮肤Trm细胞可在有效治疗后持续存在，并通过产生包括IL-17A在内的炎症细胞因子来促进疾病复发。因此，抑制皮肤中Trm细胞的生成或驻留可能是防止银屑病复发的合理策略。然而，Trm细胞在复发性银屑病中被激活的关键机制仍不清楚。

核因子-κB家族是调节先天和适应性免疫的经典蛋白复合体，通过调控大量基因的转录，对淋巴细胞的活化和存活至关重要。NF-κB的激活可通过经典和非经典信号通路发生，分别激活不同亚基。先前研究表明，NF-κB信号在效应和记忆T细胞的生成与维持中起关键作用，但其对银屑病中Trm细胞激活的影响尚属未知。

材料与方法

本研究首先建立了咪喹莫特诱导的复发性银屑病小鼠模型。具体而言，7周龄雄性BALB/c小鼠在剃除背部毛发后，除对照组外，其余小鼠连续7天接受62.5毫克/天的IMQ处理。经过14天的免疫耐受期后，复发性银屑病组小鼠再接受7天20.8毫克/天的IMQ处理以诱导复发。通过银屑病面积和严重程度指数、棘层肥厚和乳头瘤样增生来评估银屑病严重程度。

研究采用流式细胞术分析了脾脏、淋巴结和皮肤中的T细胞亚群，包括CD4⁺、CD8⁺的Tcm、Tem以及表达CD103、CD69、皮肤淋巴细胞相关抗原等标志物的Trm细胞。通过蛋白质印迹法检测了皮肤中NF-κB信号通路相关蛋白如磷酸化NF-κB p65、p-IKKα、p-RelB和NF-κB p100/p52等的表达。通过酶联免疫吸附试验测定了皮肤中IL-17A、IL-6、IL-15和TNF-α等细胞因子的水平。此外，研究还进行了适应性转移实验，将从小鼠脾脏分选出的CD8⁺或CD4⁺Tcm细胞注射到复发性银屑病小鼠体内，以观察其影响。为了验证NF-κB信号的作用，对模型小鼠使用了NF-κB抑制剂NIK SMI 1或激动剂CU-T12-9进行处理。最后，通过建立角质形成细胞与CD8⁺T细胞的共培养体系，在体外研究了直接触发NF-κB激活对Trm细胞的影响。

结果

1. 成功建立复发性银屑病小鼠模型

经过重复IMQ处理的小鼠背部出现明显的丘疹鳞屑性斑块和出血，伴有严重的表皮增生，其PASI评分、棘层肥厚和乳头瘤样增生程度均显著高于对照组。同时，皮肤中的炎症细胞因子IL-17A、IL-6和TNF-α水平也显著升高，表明复发性银屑病样皮炎模型构建成功。

2. CD8⁺Trm细胞在复发中起关键作用

在初发银屑病小鼠的脾脏和淋巴结中，CD4⁺和CD8⁺的Tcm和Tem细胞均有所增加。然而，在复发性银屑病小鼠的皮肤中，仅有CD8⁺CD103⁺、CD8⁺CD69⁺和CD8⁺CLA⁺的Trm细胞显著增加，而CD4⁺CD69⁺Trm细胞则无显著变化。此外，与皮肤Trm细胞招募和生成相关的基因IL-15、CXCR3、CXCL9和CXCL10的表达在复发小鼠皮肤中也上调。这些数据表明，CD8⁺Trm细胞，而非CD4⁺Trm细胞，在银屑病复发中更为重要。

3. CD8⁺Tcm细胞和IL-15加剧银屑病复发

为验证CD8⁺记忆细胞的作用，研究向复发性银屑病小鼠注射了从初发病鼠分离的CD8⁺Tcm或CD4⁺Tcm细胞。结果显示，注射CD8⁺Tcm细胞的小鼠比仅接受IMQ处理的复发小鼠表现出更严重的银屑病症状，皮肤中IL-17A、IL-15、IL-6和TNF-α水平也更高。而注射CD4⁺Tcm细胞的小鼠症状与IMQ组相似。此外，使用重组IL-15处理也诱发了与CD8⁺Tcm细胞注射组相似的严重银屑病样皮炎。这些发现表明，与IL-15相关的CD8⁺Trm细胞，而非CD4⁺Trm细胞，促进了银屑病的复发。

4. NF-κB信号通路在复发模型中被激活

机制探索发现，在复发性银屑病小鼠的皮肤中，经典NF-κB信号通路的磷酸化p65以及非经典通路中的p-IKKα、p-RelB和NF-κB p100/p52的表达均上调。然而，磷酸化TRAF2和p38 MAPK的水平则无变化。这些结果提示，经典和非经典NF-κB信号通路可能共同参与了复发过程中CD8⁺Trm细胞的激活。

5. 抑制NF-κB可缓解银屑病并减少CD8⁺Trm细胞

为验证NF-κB的作用，研究对复发小鼠使用了NF-κB抑制剂NIK SMI 1或激动剂CU-T12-9。NIK SMI 1处理显著改善了小鼠的银屑病症状，降低了PASI评分和表皮增生，并减少了皮肤中IL-17A、IL-6、IL-15和TNF-α的水平。同时，皮肤中的CD8⁺CD103⁺和CD8⁺CD69⁺Trm细胞数量也因NF-κB抑制而减少。相反，NF-κB激动剂CU-T12-9并未加重疾病严重程度或增加Trm细胞驻留，表明在复发模型中NF-κB信号可能已被最大程度激活。这些数据证实，CD8⁺Trm细胞的活性及其介导的银屑病复发在很大程度上依赖于NF-κB信号。

此外，研究发现，在复发小鼠的CD8⁺Trm细胞中，铜死亡相关蛋白DLAT的表达降低，而NF-κB抑制处理显著恢复了DLAT的表达。这表明NF-κB的激活可能通过抑制铜死亡来促进CD8⁺Trm细胞的驻留。

6. NF-κB在体外直接抑制CD8⁺Trm细胞分化和炎症

为阐明NF-κB在Trm细胞中的具体细胞机制，研究建立了角质形成细胞与CD8⁺T细胞的共培养体系。在IL-17A诱导的银屑病样模型中，用IL-15和TGF-β诱导CD8⁺T细胞向Trm细胞分化。NF-κB抑制剂NIK SMI 1处理显著减少了CD8⁺Trm细胞的分化，并降低了培养上清中IL-6、IL-8和IL-1β等促炎因子的水平。这些结果表明，在CD8⁺T细胞中阻断NF-κB信号，可以直接抑制其向Trm细胞分化并阻止促炎因子的产生。

讨论与结论

本研究系统阐明了CD8⁺组织驻留记忆T细胞及其上游的NF-κB信号通路在驱动银屑病复发中的核心作用。记忆T细胞触发的炎症反应是银屑病复发的主要致病机制。本研究证实，在复发性银屑病中，皮肤内活化的主要是CD8⁺Trm细胞，它们通过产生IL-17A等细胞因子驱动局部皮肤炎症。关键细胞因子IL-15以及趋化因子受体CXCR3及其配体CXCL9/CXCL10的上调，共同参与了Trm细胞的招募、生成与活化。

在分子机制上，经典与非经典NF-κB信号通路在复发模型中被共同激活。抑制该通路不仅能显著改善银屑病表型、降低炎症水平，还能直接减少皮肤中CD8⁺Trm细胞的数量，并恢复其细胞内铜死亡相关蛋白DLAT的表达。体外实验进一步证实，NF-κB信号直接调控着CD8⁺T细胞向Trm细胞的分化进程。

综上所述，NF-κB信号的激活通过驱动CD8⁺Trm细胞分化、抑制细胞铜死亡，从而促进咪喹莫特诱导的小鼠银屑病复发。靶向NF-κB信号通路以干预CD8⁺Trm细胞，可能成为预防银屑病复发的一种新颖治疗策略。