《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Characterization of gut microbiota in patients with diabetic kidney disease
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这项研究采用宏基因组测序，对比了健康人群、糖尿病（DM）患者和糖尿病肾病（DKD）患者的肠道菌群特征，旨在揭示与DKD发展相关的特定微生物标志物。研究发现，与健康对照组相比，DKD患者肠道菌群组成和功能通路发生显著变化，多种细菌的丰度与血糖（如HbA1c、空腹血糖）和肾功能指标（如BUN、UACR）显著相关。功能分析显示DKD患者富集了芳香族氨基酸合成、生物膜形成和脂多糖（LPS）生物合成等通路，提示菌群驱动的代谢和炎症通路是DKD进展的潜在干预靶点。本研究为理解肠道菌群在DKD发病机制中的作用提供了新见解。
引言
糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）是一种需要全球共同努力进行防控的重大疾病。近年来，糖尿病患病率持续上升，预计到2050年，2型糖尿病患者数量将达1.31亿。在中国，约有1.41亿成年人受其影响。糖尿病可引发多种并发症，其中糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease, DKD）是最常见的微血管并发症之一，可影响高达40%的糖尿病患者。DKD以持续性白蛋白尿和/或肾小球滤过率（eGFR）进行性下降为特征，是全球终末期肾病（ESRD）的主要原因。DKD是慢性肾病（Chronic Kidney Disease, CKD）的常见亚型，越来越多的研究表明，肠道菌群组成和功能的紊乱是CKD的特征。类似地，DKD患者的肠道菌群也存在明显失衡，与吲哚/犬尿氨酸、胆汁酸等代谢物信号、上皮屏障功能障碍、炎症和纤维化等通路相关。然而，在从DM进展为DKD的过程中，肠道菌群所扮演的具体角色仍未被充分阐明。本研究旨在通过对比健康对照、DM患者和DKD患者的宏基因组图谱，确定与DKD进展相关的菌群和功能通路，以探究在DM向DKD发展中起关键作用的致病菌，并阐明肠道菌群与糖尿病并发症之间的关联。
材料与方法
本研究在北京朝阳医院进行，共招募了140名参与者，包括55名健康对照（Healthy）、47名2型糖尿病患者（DM）和38名糖尿病肾病患者（DKD）。糖尿病诊断依据美国糖尿病协会2025年护理标准，DKD的诊断则基于糖尿病导致的肾脏损伤，并排除其他慢性肾病原因，满足特定白蛋白尿或eGFR标准。所有参与者均新确诊且未服用相关药物。研究采用无菌粪便收集管收集粪便样本，保存于-80°C。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本总DNA，并通过Illumina NovaSeq PE150平台进行鸟枪法宏基因组测序。原始测序数据经质量控制、过滤宿主序列后，使用Megahit软件进行组装。利用QIIME计算α多样性（如Shannon指数、Chao1指数）和β多样性（如主坐标分析PCoA）。基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）对非冗余基因集进行功能注释。使用Wilcoxon秩和检验、Kruskal–Wallis检验和LEfSe分析在分类、功能和基因水平进行差异分析。统计学分析使用GraphPad Prism 8和SPSS 20软件，p值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
参与者的基线信息
参与者的临床信息包括年龄、性别、身体质量指数（BMI）、糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹血糖、空腹胰岛素、血清肌酐、血尿素氮（BUN）、估计肾小球滤过率（eGFR）、尿白蛋白与肌酐比值（UACR）、急性C反应蛋白（CRP）和25-羟基维生素D3（25(OH)VitD3）。DM组和DKD组的基线信息基本匹配。DKD和DM患者的BMI值均超过24，属于超重。DM和DKD组的HbA1c水平均≥6.5%，而健康对照组在正常范围内。DM和DKD患者的血糖和空腹胰岛素水平也超出正常范围。在肾功能指标方面，DM患者的肾功能参数正常，而DKD患者除BUN外，其他指标（血清肌酐、eGFR、UACR）均出现异常。所有组的CRP水平均在正常范围内，而25(OH)VitD3水平在所有三组中均低于正常范围。
DKD患者肠道菌群的α多样性
α多样性分析用于评估微生物群落/功能的丰富度和多样性。研究发现，与健康对照组相比，DKD和DM患者的Shannon多样性指数显著更高，DKD与健康对照组之间存在显著差异。值得注意的是，健康对照组和DKD患者的Simpson指数均显著高于DM患者，三组的多样性排序为DM > DKD > Healthy。此外，三组在Chao、Ace和Sobs指数上未观察到显著差异，表明各组参与者的群落丰富度相似。维恩图显示，三组（DKD、DM和Healthy）共有的物种总数为2,728个，占总物种的80.40%，表明患者与健康个体之间存在大量相似的微生物群。这些结果通过α多样性箱线图和维恩图直观展示。
DKD患者肠道菌群的β多样性
基于Bray-Curtis距离结合ANOSIM检验的主坐标分析（PCoA）显示，DM、DKD和健康对照组之间的微生物群落组成存在显著分离。DM与DKD组之间的微生物多样性无显著差异，但患者组（DM和DKD）与健康对照组相比存在显著差异。此外，分型分析表明，健康对照组与DM和DKD组相比具有独特的肠型；具体而言，DM和DKD组主要由1型细菌主导，2型细菌占比较小，而健康对照组2型细菌的比例更高。这些结果通过PCoA图和分型分析图呈现。
肠道菌群组成与差异分析
在门水平，主要类群包括拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Bacillota）、变形菌门（Pseudomonadota）等。在属水平，主要属包括嗜胨菌属（Phocaeicola）、拟杆菌属（Bacteroides）、埃希氏菌属（Escherichia）等。与健康对照组相比，DKD患者表现出拟杆菌属、萨特氏菌属（Segatella）、埃希氏菌属、梭菌属（Clostridium）和瘤胃球菌属（Ruminococcus）的富集，而DM患者则表现出梭菌属、瘤胃球菌属和大肠杆菌（Escherichia coli）的增加。进一步的Kruskal-Wallis H检验和LEfSe分析揭示了组间的显著差异菌。Kruskal-Wallis H检验显示，嗜胨菌属、埃希氏菌属、另枝菌属（Alistipes）和副拟杆菌属（Parabacteroides）的丰度在组间存在显著差异。LEfSe分析显示，DM组中显著富集了利莫西乳杆菌（Limosilactobacillus）和地中海杆菌（Mediterraneiibacter），DKD组中显著富集了肠梭菌（Enterocloster）和志贺氏菌（Shigella），而健康组中则富集了嗜胨菌属、普雷沃氏菌属（Prevotella）和毛螺菌属（Lachnospira）。
比较分析表明，地中海杆菌、肠梭菌、志贺氏菌、利莫西乳杆菌、托马斯梭菌（Thomasclavelia）、毛梭菌（Lachnoclostridium）、Hallella、Eggerthella、Sellimonas和葡萄球菌（Staphylococcus）在DM和DKD患者组中同时富集。相比之下，多个细菌类群在DM和DKD患者中显著减少，主要包括嗜胨菌属、粪杆菌属（Faecalibacterium）、毛螺菌属、Agathobacter、Odoribacter、Paraprevotella、Hominiventricola、Coprobacter、Simiaoa和固氮螺菌属（Azospirillum）。这些结果通过展示门水平和属水平相对丰度的堆叠条形图，以及Wilcoxon检验、Kruskal-Wallis H检验和LEfSe分析的条形图来呈现。
肠道菌群功能差异分析
基于KEGG数据库的功能分析显示，在所有组中，KEGG三级通路水平的主要通路包括代谢途径、次级代谢产物的生物合成、不同环境中的微生物代谢、双组分系统和辅因子的生物合成。多变量分析显示，组间在次级代谢产物的生物合成、不同环境中的微生物代谢、双组分系统、辅因子的生物合成、ABC转运蛋白、碳代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等通路上存在显著差异。富集分析表明，与健康对照组相比，DKD患者在半乳糖代谢、丙酮酸代谢、磷酸转移酶系统（PTS）、碳代谢、甲烷代谢和ABC转运蛋白相关通路上显著富集。与健康对照组相比，DM组在碳代谢、半乳糖代谢、硫代谢、丙酮酸代谢、磷酸转移酶系统（PTS）和ABC转运蛋白等通路上显著富集。与DM组相比，DKD患者组在细菌趋化性、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、大肠杆菌（Escherichia coli）生物膜形成、鞭毛组装和脂多糖（LPS）生物合成等通路上显著富集。此外，物种分布和功能贡献分析强调，拟杆菌属、嗜胨菌属和埃希氏菌属对各种功能通路有显著贡献。这些结果通过展示KEGG通路相对丰度、差异分析和富集分析的图表来呈现。
差异肠道菌群与临床表型相关性分析
临床表型与肠道菌群结构和功能关系的评估显示，空腹胰岛素、空腹血糖、HbA1c、BMI、25(OH)VitD3和eGFR对肠道菌群有更强的影响。25(OH)VitD3、eGFR与健康对照之间的锐角表明这些指标与健康对照的菌群呈正相关。相反，空腹胰岛素、空腹血糖、HbA1c和BMI与患者组之间的锐角表明这些参数与DM和DKD患者的肠道菌群呈正相关。线性回归分析显示，CRP和25(OH)VitD3与β多样性呈负相关。Mantel检验网络热图显示，DKD患者的菌群与BMI呈显著正相关，并且菌群与BMI、HbA1c和空腹胰岛素呈显著正相关。相反，在健康对照中，菌群与BMI、HbA1c和空腹胰岛素呈负相关。Spearman相关性分析聚焦于DKD和DM患者中最显著富集和减少的细菌类群与临床表型之间的关联。分析表明，在患者中富集的细菌与大多数临床指标呈正相关，特别是BMI、HbA1c和UACR。而在健康对照中富集的细菌则主要与这些临床参数呈负相关。这些复杂的关联通过典型对应分析（CCA）、冗余分析（RDA）、线性回归图、Mantel检验网络热图和Spearman相关性热图进行可视化。
讨论
本研究发现DKD和DM患者的BMI均超过24，属于超重，这与肥胖是DKD风险因素的观点一致。HbA1c、血糖和胰岛素水平在患者组中升高，而DKD患者的肾功能指标（除BUN外）出现异常，凸显了疾病对肾脏的影响。关于肠道菌群多样性的研究结果存在不一致性，本研究发现DM和DKD患者的Shannon指数更高，Simpson指数更低，表明患者菌群多样性高于健康对照，这与部分研究相悖，提示需要进一步探索。β多样性分析显示DKD与DM患者菌群无显著差异，但与健康对照差异显著，表明疾病状态下的菌群结构发生了共同改变。
肠道共生菌与致病菌之间的平衡对于维持肠道屏障完整性和正常肾功能至关重要。在DKD患者中，这种平衡被打破。本研究发现，在DKD和DM患者中，嗜胨菌属和粪杆菌属等有益菌显著减少，而埃希氏菌属等增加。粪杆菌属和嗜胨菌属是健康对照中主要的丁酸盐生产者，具有抗炎特性，并能产生短链脂肪酸（SCFAs），这对于维持肠道健康至关重要。与DM患者相比，DKD患者中肠梭菌、志贺氏菌、毛梭菌、Hallella和Sellimonas的丰度更高，这些细菌可能在DM向DKD的进展中扮演重要角色。例如，肠梭菌的增殖可能削弱免疫治疗效果，志贺氏菌是细菌性痢疾的常见病原体，毛梭菌与循环醋酸盐水平降低、腹部脂肪增加有关，其丰度在妊娠期糖尿病女性中显著升高。
微生物和宿主衍生的代谢物是宿主-微生物群相互作用的关键“桥梁”。本研究发现，与DM患者相比，DKD患者在微生物功能上表现出显著变化，包括细菌趋化性、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、大肠杆菌生物膜形成、鞭毛组装和脂多糖（LPS）生物合成等通路的富集。芳香族氨基酸在肠道中被微生物代谢，产生硫酸吲哚酚和对甲酚硫酸等尿毒症毒素前体，这些毒素可作为芳烃受体（AHR）配体，促进肾脏和免疫部位的炎症和纤维化过程。LPS作为一种强效内毒素，可通过与Toll样受体4（TLR4）结合，增加肠道通透性，驱动NLRP3炎性体活化，从而升高循环内毒素水平，诱发与肾损伤相关的轻度炎症。生物膜形成可稳定失调的菌群群落，可能促进内毒素和尿毒症毒素的持续存在。研究中还观察到Eggerthella的增加，表明该菌可能在DM向DKD转变过程中调节苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等通路中起关键作用。
相关性分析进一步证实，肠梭菌、利莫西乳杆菌、托马斯梭菌、毛梭菌、Eggerthella、Sellimonas和葡萄球菌等与血糖指标以及肾功能参数呈显著正相关。相反，在有益菌中，除粪杆菌属、Simiaoa和固氮螺菌属外，其余七种显著减少的类群与血糖和肾脏参数均呈显著负相关。这提示肠道细菌可能通过调节色氨酸代谢、生物膜形成和LPS合成来促进从DM到DKD的进展。
本研究存在一些局限性。首先，分析是观察性的，缺乏机制和因果验证，限制了关于菌群-DKD通路的明确推断。其次，实验未包括长期随访研究。第三，这是仅限于北京地区的单中心研究。未来的工作应招募多区域、多中心、具有纵向随访和进展终点的队列，整合多组学分析，并直接量化关键代谢物以证实机制联系。
结论
本研究对DKD、DM患者和健康对照的粪便样本进行了宏基因组分析。研究结果表明，DKD患者与健康对照之间的α多样性无显著差异。然而，DKD患者的Simpson指数显著高于DM患者。在β多样性方面，DKD患者与健康对照之间存在显著差异，而DKD与DM患者之间未检测到显著差异。在微生物组成方面，地中海杆菌、肠梭菌、志贺氏菌和利莫西乳杆菌等有害菌在DKD和DM组中均富集。相反，嗜胨菌属、粪杆菌属、毛螺菌属和Agathobacter等有益细菌群落在健康对照中显著富集。值得注意的是，肠梭菌、志贺氏菌、毛梭菌、Hallella和Sellimonas在DKD患者中的丰度高于DM患者，表明这些细菌可能在从DM到DKD的进展中发挥作用。功能分析显示，与健康对照相比，DKD患者在半乳糖代谢、丙酮酸代谢和磷酸转移酶系统（PTS）等通路上显著富集，而DM患者在碳代谢、半乳糖代谢、丙酮酸代谢和PTS功能上显著富集。此外，相关性分析表明，在DKD和DM患者中显著富集的细菌与多个临床参数呈正相关，特别是HbA1c、空腹血糖和UACR。
总之，本研究阐明了DKD患者肠道菌群的独特特征，并强调了参与从DM进展至DKD的潜在微生物标志物。未来的研究应进一步探索微生物代谢物与肠道菌群之间的相互作用，以深化对它们在DKD发病机制中作用的理解。
