《Frontiers in Immunology》：Identification of plasma lipidomic biomarkers for prognostic stratification in advanced gastric cancer treated with PD-1 inhibitor plus chemotherapy
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本研究通过非靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）代谢组学分析，构建了基于六种脂质代谢物（deoxycholic acid、cholenic acid等）的风险评分模型，在晚期胃癌（GC）患者接受程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）抑制剂联合化疗的队列中，该模型显著优于年龄、性别、肿瘤分级和程序性死亡配体1联合阳性评分（PD-L1 CPS）等临床指标，为个体化预后评估提供了新工具。
引言
胃癌（GC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居第五，在癌症相关死亡率中排名第四，大多数患者在确诊时已处于晚期阶段。长期以来，标准化疗是晚期胃癌治疗的基石，但生存结果仍不理想，晚期患者的中位总生存期（OS）很少超过12个月。免疫检查点抑制剂（ICIs）的出现，特别是靶向程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）或程序性死亡配体-1（PD-L1）的抗体，已经改变了治疗格局。大型III期临床试验，如CheckMate-649和ATTRACTION-4，证实了ICIs联合化疗相较于单纯化疗能够延长无进展生存期（PFS）和OS。然而，尽管取得了这些进展，仅有部分患者能显著获益，原发性耐药和获得性耐药仍然是主要障碍。
近期研究强调了胃癌中免疫逃逸机制的复杂性，涵盖遗传改变、肿瘤突变负荷（TMB）异质性以及免疫抑制性肿瘤微环境（TME）特征等多个方面。已建立的生物标志物，如PD-L1表达、微卫星不稳定性（MSI）和爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）阳性，具有一定的预测价值，但未能完全捕捉胃癌的生物学异质性。因此，在PD-L1 CPS和临床病理特征之外，迫切需要寻找可靠且具有临床指导意义的生物标志物，以预测晚期胃癌患者从一线PD-1抑制剂联合化疗中的获益情况。在此背景下，多组学方法，特别是代谢组学，因其能够反映肿瘤细胞与宿主免疫系统之间动态的代谢相互作用而受到关注。通过分析血浆（或血清）或肿瘤组织中的代谢物，代谢组学提供了细胞功能的整合性读数，为理解免疫应答和耐药机制提供了见解。
新兴证据表明，特定的代谢特征与实体瘤（包括胃癌）中免疫检查点抑制剂的疗效相关。研究表明，氨基酸代谢、脂质利用和能量通路的改变可以调节T细胞活性，影响免疫抑制环境，并最终决定治疗结局。例如，在非小细胞肺癌（NSCLC）中，基线代谢组学分析已鉴定出与免疫治疗反应相关的预测性代谢物，这一原理正逐渐扩展到胃肠道恶性肿瘤。在胃癌中，新兴证据强调了脂质代谢和系统性炎症代谢物的改变作为治疗反应的潜在预测因子。将代谢组学整合到预测模型中，不仅有望优化患者选择，还可能为联合治疗策略揭示可干预的通路。然而，基于代谢组学的、能够前瞻性指导胃癌PD-1抑制剂联合化疗选择的生物标志物仍然定义不足且缺乏验证。基于此背景，本研究旨在填补这一空白，通过对接受一线PD-1抑制剂联合化疗的晚期胃癌患者进行血浆脂质组学分析，开发并内部验证一个基于代谢物的风险模型用于生存分层，并将其性能与常规临床标志物进行基准比较。
方法
研究设计与参与者
这项前瞻性观察性研究在福建省肿瘤医院入组了40例经组织学确诊的晚期胃癌患者，入组时间为2022年10月至2024年8月。符合条件的患者患有晚期胃癌且未接受过既往系统性治疗。所有参与者均接受一线PD-1抑制剂联合化疗（奥沙利铂联合卡培他滨）治疗，每3周一次，直至疾病进展、出现不可耐受的毒性或患者退出研究。基线人口统计学和临床数据包括年龄、性别、美国东部肿瘤协作组体力状况评分（ECOG-PS）、肿瘤分化程度和PD-L1联合阳性评分（CPS）。治疗疗效根据RECIST v1.1标准进行评估。主要终点是OS，定义为从治疗开始到任何原因死亡或末次随访的时间；PFS定义为从治疗开始到记录到疾病进展或死亡的时间。患者定期接受影像学和临床评估随访，直至2025年6月20日死亡或研究结束。本研究经福建省肿瘤医院伦理委员会批准，所有参与者均签署了书面知情同意书。
样本收集与处理
在治疗开始前，采集所有患者禁食过夜后的基线外周血样本。约5毫升静脉血收集于EDTA抗凝管中，置于冰上，并在2小时内处理。血浆通过3000 rpm、4°C条件下离心10分钟分离，分装以避免反复冻融，并储存于-80°C直至分析。进行代谢物提取时，将血浆等分试样与含有内标预冷的甲醇/乙腈溶液混合，涡旋，冰上超声，并在12000 rpm、4°C条件下离心20分钟。将上清液转移至自动进样器样品瓶中，用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。通过合并每个血浆提取物的等体积样本制备混合质控（QC）样本，并定期进样以监测分析稳定性。
LC-MS/MS分析
非靶向代谢组学分析使用ACQUITY UPLC I-Class Plus系统，耦合配备加热电喷雾电离（HESI）源的Q Exactive Plus Orbitrap质谱仪。色谱分离在45°C恒温的HSS T3色谱柱上完成。流动相由含0.1%甲酸的水（A）和含0.1%甲酸的乙腈（B）组成，采用线性梯度洗脱，在15分钟内B相从5%升至100%，流速为0.35 mL/min。进样体积为5 μL，自动进样器温度设置为10°C。质谱仪在正离子和负离子模式下运行。全扫描质谱采集的质荷比（m/z）范围为70–1050，分辨率为60,000，随后进行数据依赖的MS/MS扫描，分辨率为15,000，使用阶梯归一化碰撞能量（10, 20和40 eV）。源参数包括喷雾电压+3.8/-3.2 kV，毛细管温度320°C，鞘气35 arb，辅助气8 arb。每10个样品注射一次QC样本，以监测整个分析序列中的保留时间、质量准确度和信号强度稳定性。
数据处理与鉴定
原始LC-MS/MS数据使用Progenesis QI进行处理，包括峰检测、保留时间校正、反卷积和归一化。为控制仪器漂移，通过基于混合QC样本的局部加权散点平滑（LOESS）程序（即QC-RLSC）对特征进行校正。在每组样本中缺失值超过50%的特征被排除；剩余的缺失值采用分层策略处理：与检测限一致的零值用该离子模式/批次内最小非零强度的一半进行填补，而零星完全随机缺失（MCAR）的缺口则在Pareto缩放后使用k-最近邻（k=5）法进行填补。分析前对数据进行log2转换。代谢物注释遵循代谢组学标准倡议（MSI）指南。通过将精确质量、同位素分布和MS/MS谱图与多个数据库进行匹配来完成鉴定，这些数据库包括人类代谢组数据库（HMDB）、LipidMaps、METLIN以及LuMet-Animal 3.0内部谱图库。假定匹配要求使用Progenesis QI鉴定评分（满分80分）≥36分。已鉴定的代谢物被分为四个置信度等级：Level 1（通过相同LC-MS条件下分析真实参考标准品确认，具有一致的保留时间和高质量镜像图MS/MS谱图）、Level 2（基于谱库/参考MS/MS及精确质量/同位素证据推定性注释，无共同分析的标准品/保留时间确认）、Level 3（推定性表征的化合物类别）和Level 4（未知物）。在下游分析中，仅保留Level 1和Level 2的代谢物，并根据HMDB和LipidMaps本体论进一步分组为超类、类和亚类。
统计与建模
数据预处理和统计分析使用R软件完成。多变量分析前对数据进行Pareto缩放。主成分分析（PCA）用于评估数据质量和聚类情况，而偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）用于区分长期生存者（LTS）和短期生存者（STS）组。OPLS-DA模型的有效性通过200次标签置换进行验证。差异代谢物基于变量重要性投影（VIP）> 1.0 且学生t检验p < 0.05进行鉴定，并设定倍数变化（FC）阈值≥1.2或≤0.83。使用Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）进行多重检验校正。对于生存分析，仅考虑MSI Level 1–2的脂质和脂质样代谢物。使用单变量Cox回归筛选与OS相关的代谢物（p < 0.01），然后应用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归进行降维和防止过拟合。LASSO惩罚参数（λ）通过10折交叉验证进行调优，最终模型在λmin处选择。随后构建多变量Cox比例风险模型以生成代谢风险评分。通过Kaplan-Meier生存分析、时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线和列线图校准来评估模型性能。
内部验证、校准与决策曲线分析
为处理40例患者队列中的模型乐观度，应用了1000次重采样的Bootstrap乐观度校正，并报告了偏差校正后的判别指标，包括C-index以及6、12、18和24个月的时间依赖性曲线下面积（AUC）及其95%置信区间。使用Schoenfeld残差检验比例风险假设。使用rms包的calibrate函数，通过1000次Bootstrap重采样获得乐观度校正后的校准曲线和置信带，评估6、12和18个月时的校准情况。通过rmda包在12个月时进行决策曲线分析（DCA），评估临床效用，将风险评分与年龄、性别、肿瘤分级和PD-L1 CPS进行比较。考虑到单中心设计和内部验证，性能指标应被视为生成假设，需要外部验证。
结果
基线特征与生存结局
研究队列由40例晚期胃癌患者组成，男性略占优势，多数患者年龄超过60岁。ECOG体力状况评分普遍良好，大多数患者评分为0，且多数肿瘤分化较差。根据中位OS将患者分为LTS和STS组后，年龄、性别、ECOG评分、肿瘤分化和PD-L1 CPS的分布在两组间无显著差异。在中位随访27.0个月期间，40例患者中有30例（75.0%）发生OS事件，31例（77.5%）发生PFS事件。Kaplan-Meier生存分析显示，整个队列的中位PFS为5.5个月，中位OS为10.0个月。这些数据说明了各亚组间相对均匀的基线特征以及接受PD-1抑制剂联合化疗患者的OS模式。
代谢组学检测与QC结果
数据预处理后，在血浆样本中共检测到4298个代谢特征。QC评估证实了分析平台的稳健性。PCA显示QC样本紧密聚集，表明各次运行间性能一致。QC样本间的成对相关系数超过0.99，超过80%的检测代谢物的相对标准偏差（RSD）低于30%。过滤掉每组缺失值超过50%的峰并用半最小值强度替换零值后，将正离子和负离子数据合并为统一数据集用于下游分析。根据MSI分类，830个代谢物被注释为Level 1，1321个为Level 2，564个为Level 3，1583个为Level 4。所有下游分析仅保留注释为MSI Level 1或Level 2的代谢物。脂质相关代谢物在各类别中占主导地位，甘油磷脂、脂肪酰基和羧酸衍生物在类和亚类水平上占比最大。
多变量统计分析与差异代谢物鉴定
PCA显示LTS和STS组之间存在明显的分离趋势，反映了不同的代谢谱。OPLS-DA进一步改善了组间区分度，200次置换检验证实了OPLS-DA模型的稳健性且无过拟合。差异代谢物筛选鉴定出大量在LTS和STS组间显著改变的代谢物。火山图展示了上调和下调的特征。对这些代谢物进行的层次聚类分析显示出清晰的组别特异性模式。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析揭示了这些代谢物显著富集于多个通路，排名靠前的富集类别包括胆汁酸代谢、氨基酸代谢和视黄醇代谢。
预后代谢物鉴定与风险评分开发
从差异代谢物池中，优先选择Level 1和Level 2的脂质及脂质样分子（n=33）进行生存分析。单变量Cox回归鉴定出11个与OS显著相关的代谢物（p < 0.01），包括脱氧胆酸（FT08631NR）、胆烯酸（FT09916PR）、3'-羟基-T2毒素（FT11029NR）、5-巨豆烯-7-炔-3,9-二醇-9-葡萄糖苷（FT09305NR）、12α-羟基-7-氧代-5α-胆烷-24-酸（FT08579NR）、17-羟基雄烷-3-葡萄糖醛酸苷（FT11088NR）、赤芝酸C（FT12339PR）、皮质酮-21-半琥珀酸酯（FT11232NR）、5,6β-二氢PGI2（FT10380PR）、药西瓜素F（FT14709PR）和4-氧代-13-顺式-视黄酸（FT07813NR）。随后应用LASSO回归结合十折交叉验证来优化候选集，得到使偏似然偏差最小的最优λ值。不同λ值下的系数谱图展示了变量的逐步收缩。随后的多变量Cox回归最终确定了六个独立的预后代谢物：脱氧胆酸（FT08631NR）、胆烯酸（FT09916PR）、3'-羟基-T2毒素（FT11029NR）、5-巨豆烯-7-炔-3,9-二醇-9-葡萄糖苷（FT09305NR）、皮质酮-21-半琥珀酸酯（FT11232NR）和4-氧代-13-顺式-视黄酸（FT07813NR）。将这些代谢物整合到一个基于代谢物的风险评分中，该评分显示出独立的预后价值。
代谢物风险评分对OS和PFS的预后价值
基于六个独立预后代谢物得出的代谢物风险评分，以中位评分（0.98）为截断值，将患者分为LTS和STS组。分布图显示，较高的风险评分主要富集在STS组。与临床结局对齐的散点图表明，评分升高的患者发生事件更早，而较低的评分与更长的OS相关。六个模型代谢物的热图分析证实了LTS和STS患者之间存在不同的表达模式。Kaplan-Meier分析显示，高分数组患者的OS和PFS均显著短于低分数组。时间依赖性ROC曲线进一步验证了风险评分的预测准确性，其在6、12、18和24个月时对OS和PFS均表现出稳健的性能，AUC值持续较高。
与临床因素的整合比较及列线图构建
为了进一步评估代谢物风险评分的预后价值，将其预测性能与常规临床变量（包括年龄、性别、肿瘤分级和PD-L1 CPS）进行了比较。时间依赖性ROC分析表明，风险评分在6、12、18和24个月时 consistently 优于这些临床参数，各时间点的AUC值均更高。单变量Cox回归分析表明，风险评分、肿瘤分级和PD-L1 CPS与OS相关。多变量分析证实风险评分是一个独立的预后因素。随后构建了一个整合代谢物风险评分、肿瘤分级和PD-L1 CPS的列线图，用于预测6个月、12个月和18个月的OS概率。校准图显示预测结果与实际OS结局之间具有良好的一致性，支持了整合模型的稳健性。
模型诊断、乐观度校正与临床效用
基于代谢物的风险评分及协变量的Cox比例风险假设未违反，全局和变量水平的Schoenfeld检验以及诊断图均未显示系统性的时间趋势。在12个月时的临床效用分析倾向于代谢物风险评分：DCA显示，在广泛的阈值概率范围内，相较于“治疗所有”、“不治疗”以及临床病理基线（年龄、性别、分级、PD-L1 CPS），该评分具有更高的净获益。为处理n=40队列中的乐观度，进行了1000次Bootstrap乐观度校正。偏差校正后的Harrell's C-index和6/12/18/24个月的时间依赖性AUC值及其95%置信区间已报告；校正后总体判别能力保持中到高水平，乐观度校正后的校准显示在预设时间点上预测生存率与实际观察生存率高度一致，且置信带较窄。
讨论
本研究对接受一线PD-1抑制剂联合化疗的晚期胃癌患者的基线血浆代谢组进行了分析，并鉴定出脂质衍生代谢物作为预后生物标志物。一个由六种代谢物（脱氧胆酸、胆烯酸、3′-羟基-T2毒素、5-巨豆烯-7-炔-3,9-二醇-9-葡萄糖苷、皮质酮-21-半琥珀酸酯和4-氧代-13-顺式-视黄酸）组成的风险评分能够显著分层OS和PFS。该评分优于临床病理因素（年龄、性别、分级、PD-L1 CPS），凸显了其在标准标志物之外的附加价值。时间依赖性ROC分析显示其在早期（6-12个月）和晚期（18-24个月）时间点均具有稳定的判别能力，支持对潜在无应答者进行早期分流以及进行长期预后评估。比例风险假设得到满足。使用1000次Bootstrap乐观度校正后，偏差校正后的Harrell's C-index和时间AUC值及其95%置信区间与表观估计值保持一致，支持了尽管样本量不大但结果具有稳健性。Bootstrap校正的校准曲线及置信带表明预测生存率与实际观察生存率高度一致。12个月时的DCA显示，在临床相关的阈值概率范围内，代谢物评分比临床病理基线具有更高的净临床获益。考虑到单中心、n=40的队列以及依赖内部验证，本研究应被视为生成假设。总体而言，脂质组学为胃癌免疫治疗中的生存预测和治疗分层提供了一个补充性的、具有临床信息价值的层面，值得进行外部验证和前瞻性评估以推动临床转化。
既往研究日益强调代谢重编程在调节癌症进展和影响免疫治疗反应中的作用。在肺癌和肝细胞癌中的多项代谢组学研究报道，脂质代谢的改变与检查点抑制剂的疗效密切相关。例如，在NSCLC中，支链氨基酸和胆汁酸通路被确定为治疗结局的预测标志物；而在肝细胞癌中，联合蛋白质组学和代谢组学分析揭示了与PD-1抑制剂良好反应相关的独特脂质特征。本研究的结果与这些报道一致，鉴定出六种脂质相关代谢物可根据生存结局对患者进行分层。此外，近期研究强调胆汁酸衍生物（如脱氧胆酸）是肿瘤微环境内免疫信号的调节剂，这支持了本研究的观察结果。然而，针对胃癌的具体证据仍然有限，本研究通过证明脂质代谢物（而非传统临床生物标志物）在该患者群体中为免疫治疗结局提供了更强的预后价值，提供了新的见解。
本研究中鉴定出的六种脂质相关代谢物可能通过不同的生物学途径影响免疫治疗结局。脱氧胆酸和胆烯酸均为胆汁酸衍生物，是已知的肠道微生物群和免疫调节剂，可能影响抗原呈递和T细胞活化。已证明升高的胆汁酸通过改变树突状细胞功能和促进免疫抑制表型来塑造肿瘤免疫微环境。3’-羟基-T2毒素是一种单端孢霉烯族毒素代谢物，可能通过氧化应激和调节细胞因子释放来影响免疫功能，进而可能影响肿瘤相关炎症。5-巨豆烯-7-炔-3,9-二醇-9-葡萄糖苷是一种类胡萝卜素衍生物，可能通过抗氧化活性和与视黄醇相关的信号传导发挥免疫调节作用，这些作用与T细胞分化有关。皮质酮-21-半琥珀酸酯是一种糖皮质激素类似物，可能通过调节T细胞增殖和PD-1/PD-L1轴活性直接影响免疫检查点，从而影响检查点抑制剂的疗效。最后，4-氧代-13-顺式-视黄酸是一种视黄酸代谢物，与视黄醇信号传导密切相关，临床前模型已证明该信号传导可增强细胞毒性T细胞功能并与PD-1阻断产生协同作用。总的来说，这些代谢物汇聚于涉及胆汁酸代谢、视黄醇信号传导和类固醇激素调节的通路，这些通路日益被认为是肿瘤-免疫相互作用的调节剂。据我们所知，这是首次报道将这六种特定的血浆脂质特征与接受一线PD-1抑制剂联合化疗的胃癌队列的生存联系起来；因此，这些关联应被视为生成假设。其中两种代谢物是MSI Level-2（推定性）注释，所有六种代谢物在胃癌免疫微环境中的确切机制作用需要正交实验验证（例如，经标准品确认的LC-MS/MS、功能分析以及纵向采样）。
从临床和政策角度来看，将代谢组学生物标志物整合到胃癌管理中有潜力改变患者护理模式。目前，晚期胃癌的治疗决策很大程度上依赖于临床病理特征和PD-L1表达，但这些因素对免疫治疗反应的预测价值有限。在本研究队列中，PD-L1 CPS显示出适度的判别能力，这可能与单中心小样本量、CPS分布偏向中低值、检测/评分变异性、相对于血浆采样的肿瘤时空异质性，以及其在化疗-免疫治疗背景下梯度减弱有关；二元CPS ≥5 vs <5 的阈值也可能压缩了信号。本研究提示，基于脂质的代谢物特征可以作为补充工具，提高预后准确性，从而为个体化治疗策略提供信息。重要的是，风险评分在早期（如6个月）和晚期（24个月）时间点均表现出时间上稳定的性能，支持对潜在无应答者进行分流（以考虑调整方案或转诊临床试验）以及进行长期预后规划。例如，具有不利代谢特征的患者可考虑强化治疗方案和密切监测，而那些具有有利特征的患者或许可以安全地继续免疫治疗。在更广泛的层面上，此类生物标志物支持精准肿瘤学框架，通过识别最有可能从
