《Frontiers in Genetics》：Identification and functional analysis of a novel TRAPPC2 intronic variant in a four-generation Chinese pedigree with SEDT
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本文报道了中国一个四代X连锁脊柱骨骺发育不良（SEDT）家系，通过全外显子组测序鉴定出TRAPPC2基因的新型内含子剪接变异c.94-11C>G。小基因（minigene）等功能实验证实该变异导致异常剪接和TRAPPC2蛋白表达缺失，从而致病。此发现扩展了TRAPPC2相关疾病的基因变异谱，并对该家系的遗传咨询、产前诊断和临床管理具有重要价值。
背景介绍
X连锁脊柱骨骺发育不良（X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda, X-linked SEDT）是一种罕见的迟发性、进行性骨骼发育不良，主要影响男性，导致儿童期不成比例的身材矮小、椎体和长骨骨骺结构缺陷以及早发性退行性骨关节炎。其特征性影像学表现包括椎体扁平分叶状变形、椎间盘间隙狭窄、股骨头扁平及股骨颈缩短。X连锁SEDT与TRAPPC2（trafficking protein particle complex subunit 2）基因的致病性变异相关，该基因位于X染色体，其编码的蛋白质参与内质网（ER）到高尔基体的囊泡运输。尽管已报道68种不同的TRAPPC2变异，但多数预测会导致蛋白质翻译提前终止，其中仅有少数得到了功能研究验证。
本研究在一个具有四名患病男性的中国四代家系中，发现了一个位于TRAPPC2基因内含子三的新型非经典剪接受体位点变异c.94-11C>G，并通过小基因剪接研究和蛋白表达分析等功能实验，证实了其致病性，从而扩展了TRAPPC2相关疾病的遗传变异谱。
材料与方法
研究对象为一个呈现典型X连锁隐性遗传模式的中国SEDT家系，其系谱图如图1所示。先证者（IV-1）为一名16岁中国男性，因身材矮小就诊。收集了可用家族成员的外周血样本和临床信息进行遗传学分析。
基因分析方面，对先证者及其父母进行了三重全外显子组测序（TWES），随后利用Sanger测序在其他家系成员中验证了潜在致病变异。根据美国医学遗传学与基因组学学会指南评估了所发现变异的致病性。
针对潜在的剪接变异c.94-11C>G，研究团队进行了体外功能实验。通过小基因剪接研究，将包含野生型或变异等位基因的内含子3-外显子4片段克隆到pcMINI-C载体中，并转染至人胚胎肾细胞（HEK-293T）和人宫颈癌细胞（HeLa），通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和测序分析剪接产物。此外，还构建了携带野生型或突变型TRAPPC2 cDNA的真核表达载体（PHAGE和pEGFP-C1），转染细胞后，通过定量聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测mRNA和蛋白质的表达水平。
研究结果
临床特征
先证者（IV-1）身高137厘米，臂展150厘米，表现为不成比例的身材矮小、短颈和桶状胸。脊柱正侧位X光片显示轻度脊柱后侧凸。腰椎侧位片显示椎体扁平分叶状变形。膝关节X光片显示胫骨平台轻度扁平。骨盆X光片显示股骨头轻度扁平、髋内翻、髋关节面不规则及股骨颈短缩。家系中其他三位成年男性患者（II-1, III-13, III-18）表现出相似症状。其中65岁的II-1自17岁起出现严重的背、膝、髋部疼痛，膝关节活动受限。32岁的III-13（先证者舅舅）的X光片显示出更典型的SEDT特征，包括椎体扁平、椎间盘间隙显著狭窄、终板硬化、髋关节面狭窄及股骨颈短缩。家系中无女性患者，遗传模式支持X连锁隐性遗传。
遗传学发现
全外显子组测序和Sanger测序揭示了一个新型的半合子变异c.94-11C>G，位于TRAPPC2基因（NM_001011658.4）的内含子三，该变异遗传自先证者母亲。该变异在HGMD和gnomAD数据库中均未见报道。家系验证显示，该变异在患病男性（II-1, III-13, III-18）中以半合子形式存在，在先证者的多位母系女性亲属（II-3, II-9, II-11, IV-2）中为携带者。表型正常的男性成员未检测到此变异。生物信息学工具预测该变异会影响正常剪接。未发现其他与身材矮小相关的可能致病或致病性变异。
TRAPPC2中潜在非经典剪接变异的小基因研究
该内含子变异（c.94-11C>G）在家族中呈现共分离现象。小基因实验显示，转染野生型载体（pcMINI-C-TRAPPC2-wt）的细胞产生了预期大小的条带（约500 bp），而转染突变型载体（pcMINI-C-TRAPPC2-mut）的细胞则产生了更大的条带。对PCR产物的测序和比对分析证实，c.94-11C>G变异导致TRAPPC2 mRNA发生异常剪接，保留了内含子三中的10个碱基对，从而引起阅读框移位，最终产生一个提前终止密码子（PTC）。
异常剪接对TRAPPC2蛋白表达的影响
鉴于异常的mRNA剪接和PTC的出现，研究推测可能产生两种结果：编码C端截短的TRAPPC2蛋白，或激活无义介导的mRNA降解（NMD）。为验证此假设，研究构建了两套表达质粒。测序证实突变载体（PHAGE和pEGFP-C1）产生了c.93_94ins tgtcatctag（p.Asp32Cysfs*23）突变。qPCR结果显示，突变体的mRNA表达水平显著低于野生型。蛋白质印迹分析进一步表明，当使用pEGFP-C1载体时，c.94-11C>G变异导致产生表达量显著降低的截短TRAPPC2蛋白。而在使用PHAGE载体时，突变构建体未检测到明显条带，表明该变异激活了无义介导的mRNA降解。这些结果强调了c.94-11C>G变异导致TRAPPC2蛋白缺失，而该蛋白是前胶原从内质网输出到高尔基体所必需的。
讨论与结论
本研究在一个中国大家系中报告了TRAPPC2基因的一个新型非经典剪接位点变异c.94-11C>G。四名男性患者表现出典型的SEDT临床和影像学特征。通过小基因实验，我们确认了该变异是导致该中国SEDT家系患病的遗传基础。分析显示，c.94-11C>G变异导致TRAPPC2 mRNA额外保留了10个碱基对，引起翻译提前终止及后续蛋白质降解。作为运输蛋白颗粒复合体的一个组分，TRAPPC2的缺失可能会破坏内质网到高尔基体的囊泡运输过程。
TRAPPC2基因包含六个外显子。根据HGMD，已报告的68个TRAPPC2变异大多发生在第4-6外显子，这些外显子对蛋白质结合和维持TRAPPC2蛋白三维结构至关重要。其中13个是剪接突变。本研究发现的新变异c.94-11C>G是位于内含子3的非经典剪接变异。迄今为止，在内含子3已检测到五种致病变异，表明内含子三是TRAPPC2功能的关键高频突变区域。
SEDT是一种进行性疾病，严重影响患者生活质量，且目前尚无有效治疗方法。本研究中，患者III-13、III-18和IV-1至今未出现明显的骨关节炎症状，仅表现为身材矮小和轻度脊柱侧凸。但65岁的II-1患者报告有严重的背、膝和髋部疼痛，膝关节活动受限。影像学评估显示，16岁的IV-1未表现出明显的椎间盘间隙狭窄，而32岁的III-13则显示椎间盘间隙显著狭窄和终板硬化。早期诊断有助于对症治疗。遗憾的是，产前超声无法诊断患病胎儿。但由于获得了基因突变信息，遗传咨询、扩展家系筛查和产前诊断对该家庭而言都是可行的选择。对于携带者女性，每次怀孕有50%的风险生下患病男性后代，50%的概率女性后代成为携带者。男性患者则会将变异传递给所有女儿（必然携带者），而所有儿子均不受影响。所有携带者女儿在成年后，特别是在计划怀孕时，应接受遗传咨询。胚胎植入前遗传学检测可作为一种生殖选择。
综上所述，通过基因检测和功能研究，我们在一个中国SEDT家系中鉴定出TRAPPC2基因的一个新型致病的非经典剪接变异c.94-11C>G。这一发现扩展了TRAPPC2基因的突变谱，并使针对该家系的多种临床干预成为可能。
