《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：An integrative ultrastructural and transcriptomic analysis of host–pathogen interactions with human brain microvascular endothelial cells during cryptococcal infection: a preliminary study
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本研究通过整合透射电子显微镜（TEM）与高通量双重RNA测序（RNA-Seq）技术，系统性分析了临床与环境来源的隐球菌（Cryptococcus neoformans/gattii）侵染人脑微血管内皮细胞（HBMECs）过程中引发的超微结构改变与转录组动态。研究发现，两类菌株均能诱导HBMECs发生膜皱褶、线粒体肿胀、内质网扩张、自噬体形成等显著亚细胞结构重塑，并激活PI3K-Akt、IL-17、p53等关键免疫信号通路。病原体则上调毒力相关基因表达，涉及黑色素合成、细胞壁重塑及应激适应等机制。该研究揭示了血脑屏障（BBB）在隐球菌侵袭过程中的保守宿主-病原互作机制，为抗真菌治疗靶点开发提供了新视角。
1 引言
隐球菌病是由环境真菌新型隐球菌和格特隐球菌引起的侵袭性疾病，可进展为隐球菌性脑膜炎，对中枢神经系统（CNS）造成严重损害。病原体突破血脑屏障（BBB）是侵入脑实质的关键步骤，而BBB主要由特化的脑微血管内皮细胞（BMECs）构成。尽管其临床意义重大，但针对环境分离株在BBB处的宿主-病原体互作机制仍知之甚少。本研究通过结合高分辨率透射电子显微镜（TEM）与双重RNA测序（RNA-Seq），旨在系统性揭示临床与环境来源隐球菌侵染HBMECs过程中引发的超微结构改变与转录组动态。
2 材料与方法
研究使用临床与环境分离的隐球菌菌株（包括C. neoformans与C. gattii）在4小时（hpi）和18小时两个时间点侵染HBMECs。通过TEM观察宿主细胞超微结构变化，并利用双重RNA-Seq同步分析宿主与病原体的差异基因表达。生物信息学分析包括基因本体（GO）富集、KEGG通路分析，并通过qPCR验证关键基因表达。
3 结果
3.1 感染HBMECs的细胞形态学变化
TEM显示，感染后的HBMECs出现显著膜皱褶、微绒毛增生、自噬体形成等结构改变。隐球菌可诱导细胞膜内陷，通过微绒毛延伸包裹病原体。自噬作为宿主防御机制，通过形成自噬体降解细胞内病原体或受损细胞器。
3.2 超微亚细胞结构改变
线粒体在感染后期出现肿胀、嵴结构破坏等严重功能障碍；高尔基体发生碎片化与分布异常；内质网呈现碎片化、囊泡化及核糖体脱落；细胞核出现不规则变形与膜破裂；细胞质内应激纤维增稠并形成空泡。这些改变提示宿主细胞在感染压力下发生广泛亚细胞重构。
3.3 临床与环境分离株诱导的超微结构响应比较
两类菌株在4小时和18小时时间点诱导的HBMECs超微结构改变高度一致，表明环境分离株具有与临床菌株相当的侵袭潜力。
3.4 宿主与病原体的双重RNA-Seq分析
测序数据质控良好，宿主与病原体基因映射率符合预期。HBMECs中差异表达基因（DEGs）显著富集于免疫应答、细胞粘附、自噬、缺氧反应等生物学过程。病原体基因表达分析显示，与毒力相关的黑色素合成、胶囊形成、应激适应等通路被激活。
3.5 HBMECs差异表达基因的功能富集分析
GO分析显示，上调基因与整合素介导的细胞粘附（如VTN、ITGB3）、免疫调节（如CCL5、IL34）、自噬（如DDIT3、TRIB3）等过程相关。KEGG通路富集发现PI3K-Akt、p53、HIF-1、IL-17等信号通路被显著激活。立即早期基因（IEGs）如FOS、JUN、EGR1在感染早期快速响应，发挥双重转录调控作用。
3.6 病原体转录组响应与毒力相关通路
隐球菌在感染过程中上调与细胞骨架重组、自噬、尿素循环、黑色素合成等相关的基因。病原体通过调节肌醇代谢、泛素化修饰等机制增强对宿主环境的适应性与致病力。
3.7 差异基因验证
qPCR验证显示RNA-Seq数据具有高可靠性（Pearson r=0.8858, p=0.00341），证实转录组分析结果的准确性。
4 讨论
本研究通过整合超微结构与转录组学数据，揭示了隐球菌侵染BBB过程中宿主-病原体互作的早期事件。HBMECs通过膜动态重构、细胞器应激响应、自噬等机制对抗感染，同时激活多条免疫信号通路。环境分离株展现出与临床菌株相似的侵袭能力与宿主响应模式，提示其潜在的致病相关性。研究为阐明隐球菌突破BBB的分子机制提供了新见解，并为抗真菌药物靶点开发提供了理论依据。未来研究可结合3D BBB模型与功能验证，进一步深化对宿主-真菌互作机制的理解。
