健康人群中抗IdeS抗体流行率及中和潜力的新型检测方法评估

《Frontiers in Immunology》：Novel assays to assess the prevalence and neutralizing potential of anti-IdeS antibodies in healthy humans

本研究开发了定量检测抗IdeS IgG/IgA抗体及其中和活性的新方法，揭示健康人群中虽普遍存在结合抗体（IgG 96.3%，IgA 85.3%），但仅约1%个体具有临床意义的IdeS中和活性。该发现为IdeS（Idefirix?）在肾移植脱敏等治疗中的个体化应用提供了关键风险评估工具。

　　

背景

IdeS（IgG降解酶），也称为imlifidase，是由化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）产生的一种半胱氨酸蛋白酶。这种酶具有高度特异性，能够水解人类IgG，通过在铰链区切割，将IgG分子分解为F(ab′)₂片段和Fc区域，从而显著加速IgG的分解代谢。IdeS的治疗形式（Idefirix^?）目前已被批准用于接受肾移植的患者，以清除供体特异性IgG，以及用于治疗Goodpasture综合征，以去除致病性的抗肾小球基底膜抗体。先前的研究已在健康个体和肾移植受者中报道了针对IdeS的IgG抗体的存在。然而，抗IdeS的IgA抗体以及IdeS中和抗体的出现频率及其潜在的临床意义尚未得到充分研究。

方法

在本研究中，研究人员开发了半定量酶联免疫吸附测定（ELISA），合成了特定的IdeS底物，并验证了一种定量中和测定法，用于检测和量化健康人血浆和血清样本中的抗IdeS IgG、抗IdeS IgA以及IdeS中和抗体。

结果

研究结果证实，在治疗用的混合正常人IgG（IVIg）制剂中，存在能够中和IdeS酶活性的抗IdeS IgG。在136名健康个体的血浆和血清中，超过85%的个体检测到了抗IdeS IgG和IgA抗体。然而，仅在约1%的受试个体中发现了具有临床显著水平的IdeS中和活性。IdeS中和活性完全由IgG介导，而非IgA，并且与抗IdeS IgG的水平没有系统的相关性。

结论

抗IdeS IgG和IgA在正常人群中高度流行，这可能与反复的化脓性链球菌感染有关。然而，研究发现具有临床相关水平的IdeS中和抗体的流行率很低。这些发现强调需要进行一项前瞻性临床试验，以评估肾移植受者体内IdeS结合抗体和IdeS中和抗体的水平。本研究开发的新型功能性IdeS中和测定法为指导个体化医疗和确定患者是否符合基于IdeS的脱敏治疗方案提供了预测工具。

引言

IdeS通过精确切割IgG重链（在IgG1、IgG3和IgG4中位于G236和G237之间，在IgG2中位于A236和G237之间）来发挥其功能。其活性位点Cys⁹⁴的突变（如变为丝氨酸，即IdeS^C94S）会使酶失活。IdeS除了水解人IgG外，也能水解兔和猴的IgG。通过去除Fc片段，IdeS不仅阻断了IgG的Fc依赖性功能（如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖的细胞毒性（CDC）），还加速了F(ab′)₂片段的清除，因为这些片段不再能通过结合新生儿Fc受体（FcRn）而被循环利用。IdeS的治疗潜力已在肾移植致敏患者和Goodpasture综合征患者中得到证实，并在多种自身免疫性疾病的临床前模型中显示出应用前景。

然而，IdeS的应用面临着一个挑战，即由于既往化脓性链球菌感染而产生的预存免疫力。研究表明，在咽扁桃体炎、菌血症和丹毒患者中，抗IdeS IgG水平会升高。健康个体和慢性肾病患者中也存在抗IdeS IgG。相比之下，抗IdeS IgA的存在则不甚明确。考虑到化脓性链球菌感染通常通过皮肤或黏膜发生，理应引发黏膜免疫，但据研究者所知，健康供体中抗IdeS IgA的存在此前尚未有报道。研究人员假设，抗IdeS IgG和/或IgA可能会影响IdeS的治疗效果。

目前，对IdeS抗体中和活性的研究尚不充分。已有报道称，在化脓性链球菌感染患者的血清中检测到了IdeS中和抗体，且中和活性存在于IgG组分中。然而，另一项研究却发现，19名健康供体的血清中的抗IdeS抗体，在体外使用能完全切割人血液中IgG的IdeS浓度时，并未使IdeS失活。有趣的是，治疗用的混合IgG（IVIg）中却被报道含有IdeS中和IgG。与此一致的是，近期研究显示IdeS在不同肾移植患者中的疗效并不相同，尽管尚未研究与预存IdeS中和抗体的关联。

据研究者所知，目前尚缺乏可靠的方法来定量检测抗IdeS IgG（以往研究多依赖IVIg作为标准，且缺乏人源抗IdeS IgG标准品），同时也缺乏灵敏、定量、高通量的IdeS中和抗体检测方法（以往多使用SDS-PAGE法）。本研究旨在解决这些问题。

材料与方法

研究使用了多种重组人IgG₁单克隆抗体（如BO2C11、KM41等，部分来自血友病A患者，部分为实验室生成）、曲妥珠单抗（Trastuzumab）、野生型IdeS及其失活变体IdeS^C94S，以及来自健康供体的静脉注射免疫球蛋白（IVIg）。健康供体的血浆（N=80）和血清（N=56）样本来自法国血液机构。

为了建立定量标准，研究人员通过用IdeS免疫小鼠，获得了产生抗IdeS IgG的B细胞杂交瘤（克隆29，cl29），并将其VH和VL基因克隆到人IgG或IgA表达载体中，从而生产出人源化的重组抗IdeS IgG^cl29和IgA^cl29。在重组IgG₁中，将人铰链区替换为小鼠IgG₁的铰链区，以防止被IdeS切割。

抗IdeS抗体结合ELISA的方法是：用IdeS^C94S包被ELISA板，加入待测样本（IVIg、人血浆/血清、单克隆抗体等）孵育后，分别使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人IgG Fc抗体或抗人IgA抗体进行检测。竞争性ELISA则是在样本加入前，先与可溶性IdeS^C94S预孵育。使用IgG^cl29和IgA^cl29作为标准品来定量人血浆/血清中的抗体水平，并计算了检测的空白限（LOB）、检测限（LOD）和定量限（LOQ）。

为了评估IdeS的酶活性和中和作用，研究合成了一个基于荧光共振能量转移（FRET）的IdeS人工底物。该底物由增强青色荧光蛋白（eCFP）和Venus荧光蛋白分别与人IgG1的铰链-CH2-CH3区域（从残基A231开始）融合，并通过CH3结构域的突变（E356K/D399K与K392D/K409D）促进异源二聚化形成。当底物完整时，434 nm激发eCFP会导致Venus发射528 nm荧光（FRET效应）；当被IdeS切割后，FRET信号消失，eCFP在477 nm的发射光增强。通过测量530 nm和484 nm的荧光强度比值（F_{530 nm}/F_{484 nm}）可以量化底物水解程度。利用该底物，研究人员建立了IdeS中和测定法：将IdeS与待测样本（血浆/血清、IVIg或纯化IgG）预孵育后，加入FRET底物继续反应，最后用碘乙酰胺终止反应并检测荧光。根据IdeS的药代动力学研究，定义了测定中的“临床相关IgG/IdeS比率”（对应于检测时血清/血浆1:10稀释，IdeS浓度为24 nM）。

此外，还使用Melon Gel试剂盒从血浆/血清中纯化IgG，或用蛋白A琼脂糖珠去除IgG，以验证中和活性的来源。

结果

IdeS中和IgG存在于IVIg中

研究首先证实IVIg中含有抗IdeS IgG，它能以剂量依赖的方式结合固定的IdeS^C94S，且这种结合可被可溶性IdeS^C94S竞争性抑制。作为对照，7种非IdeS特异的人IgG₁单克隆抗体均不结合IdeS，表明IVIg与IdeS的结合是通过Fab片段而非作为底物样结合。酶切实验显示，IdeS能完全水解单克隆抗体BO2C11，但对IVIg的水解却不完全，存在完整的IgG残留。当IVIg预先与IdeS^C94S孵育（饱和其中的抗IdeS IgG）后，再加入IdeS，则能恢复完全水解，表明IVIg中含有的抗IdeS IgG能够中和IdeS的蛋白酶活性。

为了量化中和活性，研究人员开发了FRET底物。该底物可被IdeS剂量和时间依赖性地切割，导致F_{530 nm}/F_{484 nm}比值从切割前的1.63 ± 0.26降至完全切割后的0.68 ± 0.03。动力学分析得出其K_m为6.07 μM，K_cat为12.25 s^-1，与文献报道的IdeS参数相似。利用该底物建立的中和测定显示，IVIg能剂量依赖性地中和IdeS活性，且中和程度取决于所使用的IdeS浓度。计算得出在不同IdeS浓度下，引起50%中和所需的IVIg浓度在1.4至9.1 μg/ml之间。

健康个体中抗IdeS IgG和IgA的流行率

研究人员使用人源化抗IdeS IgG^cl29和IgA^cl29作为ELISA定量标准。IgG^cl29能剂量依赖性地结合天然IdeS和IdeS^C94S，其结合可被可溶性IdeS^C94S抑制。IgA^cl29也能剂量依赖性地结合IdeS。使用IgG^cl29作为标准，测得IVIg（10 mg/ml）中抗IdeS IgG的浓度为49.6 ± 3.8 μg/ml。

对136名健康供体（血浆80人，血清56人）的检测显示，血清中测得的抗IdeS IgG和IgA水平均高于血浆，这与血清中总Ig浓度较高一致。在血浆中，抗IdeS IgG的平均浓度为23.89 ± 22.03 μg/ml（范围0.80-131.30 μg/ml），抗IdeS IgA为0.993 ± 3.007 μg/ml（范围0.010-23.160 μg/ml）。在血清中，抗IdeS IgG为36.91 ± 26.00 μg/ml（3.47-115.30 μg/ml），抗IdeS IgA为2.201 ± 4.595 μg/ml（0.0-25.740 μg/ml）。抗IdeS IgG和IgA的水平在男女性别间以及不同年龄组间均无显著差异。有5名供体的抗IdeS IgG水平低于定量限（LOQ_IgG= 2.34 μg/ml），20名供体的抗IdeS IgA水平低于定量限（LOQ_IgA= 0.023 μg/ml）。因此，在该队列中，抗IdeS IgG的流行率为96.3%，抗IdeS IgA的流行率为85.3%。与IVIg和IgG^cl29类似，供体血浆中的IgG与固定化IdeS^C94S的结合也可被可溶性IdeS^C94S抑制。合并血浆和血清数据后分析显示，抗IdeS IgG和IgA水平之间存在微弱但具有统计学意义的正相关。

健康供体血液中含有IdeS中和IgG

使用IdeS浓度为24 nM、血浆/血清稀释度为1:2.5的条件进行中和测定，发现80份血浆中有3份（3.75%），56份血清中有4份（7.14%）的IdeS中和活性大于70%。IdeS中和活性大于70%的样本，其抗IdeS IgG水平均≥9.95 μg/ml或抗IdeS IgA水平均≥0.05 μg/ml，但大多数高于此阈值的样本并未表现出IdeS中和活性。当使用临床相关的IgG/IdeS比率（血清/血浆1:10稀释）进行测定时，仅有一份样本显示IdeS中和活性大于70%。IdeS中和活性与抗IdeS IgG或IgA水平之间存在正相关，但拟合优度较差。为了确定中和活性的来源，研究人员从4名具有可检测中和活性的供体的血浆/血清中纯化了IgG。结果显示，中和活性存在于原始血浆/血清和纯化的IgG组分中，而在去除IgG后的流穿液中完全消失。并且，纯化IgG的中和活性呈剂量依赖性。

讨论

本研究描述了在健康成年供体队列中抗IdeS IgG、IgA以及IdeS中和抗体的流行率。研究人员开发了使用重组人源化抗IdeS IgG^cl29作为标准品的内部ELISA来定量抗IdeS IgG。IgG^cl29不中和IdeS，其通过Fab片段与IdeS结合，而非作为底物。该测定的定量限与以往使用商业试剂盒的研究结果相近。研究发现，在10 mg/ml的IVIg中，抗IdeS IgG浓度为49.6 μg/ml，在超过95%的健康个体中也能检测到，平均浓度与之前的一些研究报道相近但存在差异，这可能与使用的标准品和方法不同有关。健康个体中存在抗IdeS IgG被认为是既往化脓性链球菌感染的结果。

本研究首次提供了健康人群中存在抗IdeS IgA的证据。由于IgA不是IdeS的底物，其在IdeS治疗期间不会被清除，这一点与抗IdeS IgG不同。使用与IgG^cl29具有相同VH和VL区的IgA^cl29作为标准，发现超过80%的个体存在抗IdeS IgA。尽管抗IdeS IgG和IgA浓度个体差异很大，但两者水平呈显著正相关。血清中抗IdeS IgG/IgA的比值高于总血清IgG/IgA的比值，这可能反映了在化脓性链球菌感染中，血清IgG免疫应答优于黏膜IgA应答。

预存抗IdeS抗体可能通过加速IdeS清除、引发免疫复合物介导的超敏反应或中和IdeS而影响其疗效。此前研究在急性链球菌感染患者中发现较高的IdeS中和抗体流行率，而在健康个体中的研究结果存在矛盾，且IVIg中被证实含有中和活性。本研究开发的新型定量FRET中和测定法解决了以往依赖SDS-PAGE等方法的局限性。该测定灵敏度高，且能适应多种生物流体。使用该方法证实了IVIg中含有IdeS中和IgG，其中和程度取决于IdeS的用量。在模拟临床相关IgG/IdeS比率的条件下，仅在约1%的健康个体中检测到具有临床意义的IdeS中和活性。这表明健康个体中存在的抗IdeS抗体，其表位特异性存在差异，只有少数靶向IdeS的催化位点或底物结合域，这与急性感染期患者的中和抗体主要靶向催化域，而健康供体中以非中和性抗体为主的现象一致。中和活性确由IgG介导，但不排除血清/血浆中浓度较低的抗IdeS IgA可能具有未被检测到的潜在中和活性。

综上所述，抗IdeS IgG和IgA在绝大多数健康个体中存在，但仅约1%的个体产生具有临床相关性的中和活性。未来需要在不同地理人群和特定疾病（如慢性肾病）患者中进一步验证这些发现的普遍性。本研究开发的检测方法为评估肾移植受者等患者在接受IdeS治疗前后的抗体水平提供了不可或缺的工具，有望成为指导IdeS个体化脱敏治疗决策的预测性工具。