《Frontiers in Microbiology》：Dynamics and function of the GET system microbial community: insights into the role of the genus Bacillus in biogas production
引言
稻田产生的甲烷排放已被确导致全球变暖的重要温室气体来源。稻田中普遍存在的厌氧环境为甲烷生产创造了最佳条件，而稻草残留物是产甲烷微生物的主要底物。为减少这些排放，研究人员探索了多种策略，例如交替干湿和中季排水。与传统控制稻田甲烷排放的方法不同，我们利用稻田甲烷生产的原理和特征开发了一项名为GET系统的技术。GET系统是一种高效的可再生能源生产系统，利用稻田作为天然发酵罐，稻草作为发酵底物，现场高效生产沼气，从而无需传统的发酵工厂。此外，稻草中25.7%的碳同时作为发酵残留物储存在土壤中，提高了土壤肥力并形成了碳汇。因此，GET系统是一项颠覆性技术，为减少大气温室气体提供了潜在解决方案。
GET系统同时解决了推动全球低碳可持续发展的三个关键问题：稻田甲烷排放、稻草废弃物管理和可再生能源生产。我们之前的研究证实，GET系统在最佳稻草添加量为14 kg/m2、操作参数为pH 6.0–6.6、氧化还原电位低于-200 mV、发酵温度在20-30°C之间时，每公斤未处理稻草可生产高达300升沼气，甲烷浓度超过60%。然而，GET系统在此环境下高效生产沼气的机制仍不清楚。
尽管最近的研究已开始广泛研究产甲烷菌的分解过程和群落结构，但稻草分解，特别是纤维素的复杂过程仍存在争议。因此，阐明GET系统中参与稻草分解和甲烷发酵的微生物群落结构将有助于提高和扩大GET系统的可再生能源生产能力。
在传统的厌氧消化过程中，挥发性脂肪酸（VFAs）的浓度已被广泛认为是评估底物厌氧生物降解性的关键参数。值得注意的是，乙酸是甲烷生成的关键底物，对产甲烷微生物群落的增殖和代谢功能具有显著影响。由于GET系统通过每2个月将未加工的稻草与土壤混合即可实现每公斤稻草300升的高效沼气生产，本研究旨在通过VFAs的定量分析以及使用新一代测序（NGS）技术和实时定量PCR分析微生物群落结构来阐明这种高生产率的原因。
材料与方法
在GET系统中，沼气产量和甲烷浓度在第二次添加稻草后显著增加。为解析这种特征性反应背后的微生物和代谢过程，以3-5天的间隔收集土壤样品。该采样策略旨在捕捉底物周转早期阶段挥发性脂肪酸（VFAs）的短期波动和微生物群落结构的相应变化。
基于从土壤样品中提取的DNA进行新一代测序（NGS），用于观察GET系统中参与稻草分解和甲烷发酵的微生物群落结构，这提供了跨采样点分类结构的全面概览。然而，由于基于DNA的NGS图谱包括活性和非活性种群，因此需要额外的方法来评估代谢活跃的微生物，并验证高通量测序所提示的时间变化。
因此，采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）作为补充方法，以可视化跨采样点占主导地位和动态变化的微生物种群。DGGE能够直接比较随时间变化的条带模式，并作为确认群落结构主要变化的有效工具，特别是在定量分析之前针对特定微生物群。
为了进一步评估微生物活性，从相同的土壤样品中提取总RNA并逆转录为cDNA。然后使用特异性引物进行实时定量PCR（qPCR），以量化所选分类群和功能组的RNA衍生基因拷贝数的时间变化。基于RNA的qPCR允许将转录活跃的种群与休眠或残留DNA区分开来，从而能够将基因拷贝数动态解释为微生物活性的指标，而不仅仅是存在。
通过将VFA谱与基于NGS的群落结构、基于DGGE的模式验证和基于RNA的qPCR活性数据相结合，本研究建立了一个多层分析框架，以评估GET系统效率在第二次添加稻草后显著不同的原因。
GET系统的构建方法在我们之前的论文中有所提及。简而言之，将晒干的稻草切成约15厘米长，与稻田土壤混合，然后使用旋耕机构建一个气体采样床（长4.5米，宽0.8米，高0.2米），该床由一个产气床（长3.0米×宽0.8米×高0.2米）和一个土壤采样床（长1.0米×宽0.8米×高0.2米）组成。将pH和氧化还原电位（Eh）计以及土壤孔隙水收集器安装在气体采样床中心与地面相同的高度。气体和土壤采样床（即发酵床）用不透水橡胶板覆盖，并用土壤密封边缘。通过橡胶板顶部的接口连接气体收集装置后，淹没实验区域以制造厌氧发酵床并用水压密封气体采样床。实验使用三个床进行。
稻草添加分三次进行，间隔为2个月：第一次添加为14 kg/m2，第二次添加为14 kg/m2，第三次添加为7 kg/m2。在添加稻草后，每3-5天采集一次样品，用于分析沼气体積、沼气中的甲烷浓度以及VFAs的浓度。从三个并行操作的发酵床中各收集沼气、土壤和VFA样品。
基于沼气体積、VFA和甲烷浓度的动态，采集从F_1到F_10的土壤样品。
使用土壤孔隙水收集器从气体采样床收集土壤孔隙水样品（2 mL）。为纯化水样，向水样中加入等体积的氯仿，然后进行涡旋混合和离心。回收水相上清液，并通过0.2 μm PTFE膜过滤器过滤。
使用配备电导检测器的高效液相色谱（HPLC）有机酸分析系统对挥发性脂肪酸进行定量。分离在两个串联的Shim-pack SCR-102H色谱柱上进行，柱温维持在40°C。进样体积为50 μL，自动进样器设置为4°C。流动相由（A）5 mM对甲苯磺酸钠和（B）含有20 mM Bis-Tris和100 μM EDTA的5 mM对甲苯磺酸钠组成，流速为0.8 mL/min。总运行（分析）时间为55分钟。
通过外标法使用混合有机酸标准品进行定量，浓度以mg/L报告。
使用FastDNA? SPIN Kit for Soil从土壤中共同提取DNA和RNA，并按照制造商的方案进行，略有修改。简而言之，将250 mg土壤（而非试剂盒推荐的500 mg）放入裂解基质E管中，并在-80°C下预冻过夜。通过珠磨破碎细胞（两个循环，每个循环40秒，速度6.0，循环之间在冰上冷却），并通过离心澄清裂解液。根据试剂盒说明从结合基质部分纯化DNA，并在150 μL DES中洗脱。相应的上清液用于按照基于试剂盒的程序（包括醇沉淀和无RNase操作）纯化RNA，最后将RNA重悬于无RNase水中。
使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit按照制造商的方案合成cDNA。
针对梭菌的DGGE的PCR扩增在50 μL反应体系中进行，使用KOD One? PCR Master Mix和引物Chis150f（5′-AAAGGRAGATTAATACCGCATAA-3′，携带5′ GC夹）和ClostIr（5′-TTCTTCCTAATCTCTACGCA-3′）。热循环条件为：98°C 5分钟；35个循环的98°C 5秒，62°C 5秒，72°C 10秒；然后72°C 3分钟。通过2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳5 μL PCR产物确认扩增子大小和特异性。
使用DCode通用突变检测系统进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）。将PCR产物（每孔50 ng）在10%（w/v）的聚丙烯酰胺凝胶上分离，该凝胶含有10-60%的变性梯度（针对梭菌）。100%变性剂定义为7 M尿素和40%（v/v）甲酰胺。使用Model 475梯度输送系统产生梯度。在1× TAE缓冲液中，58°C下进行电泳，预运行在160 V下进行10分钟，随后在160 V下电泳12小时（针对梭菌DGGE图谱）。
电泳后，用SYBR Gold染色30分钟，轻轻摇晃，并在紫外光下观察。切取感兴趣的显性条带，将DNA在50 μL无菌水中洗脱过夜。回收的DNA使用KOD One? PCR Master Mix和引物150f（5′-AAAGGRAGATTAATACCGCATAA-3′）和ClostIr（5′-TTCTTCCTAATCTCTACGCA-3′）在20 μL反应体系中重新扩增。
使用QIAquick PCR纯化试剂盒按照制造商的说明纯化PCR产物。将纯化的样品外包进行测序。纯化的样品送至分析公司进行测序。通过NCBI BLAST搜索确定的核苷酸序列的同源性。
提取的基因组DNA用于Illumina MiSeq文库制备和双末端测序。使用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）扩增16S rRNA基因的V3–V4区域，以表征GET系统中的微生物群落结构和多样性。
使用Trimmomatic v0.38通过滑动窗口方法对原始读段进行质量过滤；当窗口内的平均Phred质量值低于Q20时，修剪碱基，修剪后短于50 bp的读段被丢弃。使用Cutadapt v1.16去除接头和引物序列。
使用在QIIME2中实现的DADA2进行降噪和扩增子序列变异（ASV）推断。使用maxN = 0以及最大预期错误阈值maxEE = 2（正向读段）和maxEE = 3（反向读段）进行质量过滤。使用learnErrors函数从数据中学习错误模型，然后进行去重复和ASV推断。合并双末端读段，最小重叠为12 bp，要求重叠区域序列一致，并使用共识方法去除嵌合序列。
使用mothur对代表性ASV序列进行分类学分类，对照Greengenes和RDP参考数据库，置信度阈值为0.6。去除没有分类学分配的ASV。此外，在下游分析之前，排除分配给非目标组（例如，细菌16S数据集中的古菌分配）的ASV。
将纯化的样品送至分析公司进行测序。通过NCBI BLAST搜索确定的核苷酸序列的同源性。
使用Step One Plus?进行实时PCR以量化基因转录。目标基因的序列和用于扩增它们的引物见补充表S2。实时PCR的反应组成和反应条件见补充表S3。为制备校准曲线，使用在制备标准片段时制备的质粒DNA以及C. butyricum Prazmowski 1880菌株和B. cereus菌株CCM2010的基因组DNA。所有实验均进行三次重复，结果表示为平均值±标准差。
结果
GET系统中VFAs的动态变化
挥发性脂肪酸（VFA）浓度被广泛认为是评估厌氧消化过程的关键参数。特别是乙酸，是甲烷生产的关键底物，影响产甲烷微生物群落的增殖和代谢功能。因此，本研究首先进行了VFA的定量分析，并基于通过上述实验方案生成的序列数据检查了微生物群落的整体结构演变。
在GET系统中，主要检测到三种VFA，即乙酸、丙酸和丁酸。在实验开始后的5天内，乙酸和丁酸的浓度急剧上升，并在第9天（F_2）分别达到最大值75 mM和15 mM。然后它们的浓度迅速下降，在第22天接近零，并在第40天（F_5）变得检测不到。相反，丙酸显示出更渐进的增加，在第27天（F_4）达到其最高浓度（20 mM）。虽然丙酸在检测到的四种酸中持续存在时间最长，但它也从第30天开始下降，在第40天（F_5）骤降至零。
在第二次添加稻草后，尽管沼气产率显著增加，并且甲烷浓度在第19天（F_3）达到60%并在此后保持恒定，但未检测到VFA。这表明稻草被迅速水解为单糖（如葡萄糖），产生的单糖转化为VFA，然后VFA被迅速用作甲烷生产的底物而没有积累。
由于VFA是厌氧发酵过程中甲烷生成的重要中间体，因此，我们的结果鼓励阐明GET系统中的微生物群落结构。
基于NGS结果的分类
门水平分类和聚类
在门水平上，鉴定出34个门，其中以下5个门占主导地位：变形菌门（32.5%）、厚壁菌门（17.8%）、放线菌门（11.2%）、绿弯菌门（10%）和酸杆菌门（8.6%），是优势类群，占优化序列总数的9%以上。在其他样品中也发现了丰度较低的门，如拟杆菌门、广古菌门和硝化螺旋菌门。
尽管变形菌门是GET系统中比例最大的优势门，但其丰度在第二次添加稻草后趋于下降。相反，厚壁菌门的丰度显著增加。
通过聚类关系，两组之间最大的差异来自第二次添加稻草后厚壁菌门丰度的四倍增加。尽管F_6是第一次添加稻草后发酵过程的最后阶段，但由于F_6中厚壁菌门丰度的显著增加，聚类关系将F_6归类到第二次添加稻草后的组中，表明GET系统中适宜的微生物群落结构的富集在第一次发酵阶段结束时（F_6）已完成变化。
属水平分类和聚类
在GET系统的属水平分析中，所有样品中总共鉴定出54个属。丰度的最大比例属于未分类的属，平均丰度为59%，主要来自变形菌门。第二次添加后，随着芽孢杆菌的增加，未分类的属减少。
芽孢杆菌的丰度从F_5的3.2%增加到F_6的16.2%。在第二次添加稻草后，芽孢杆菌的平均丰度保持在15%左右，比第一次添加稻草后高出约五倍。相比之下，梭菌的丰度在整个实验过程中没有显示出显著变化，始终保持在2%左右。芽孢杆菌是影响GET系统中累积微生物群落结构的主要因素，这一事实表明它可能与第二次添加稻草后沼气产量的显著增加有关。在GET系统中，乙酸裂解甲烷鬃毛菌属是属水平上唯一占优势的产甲烷菌，平均丰度为1.5%。第一次添加稻草后的丰度高于第二次添加稻草后的丰度。
基于实时PCR的物种水平定量分析
实时定量PCR（qPCR）是定量特定DNA或RNA序列的关键方法，在分析微生物群落组成变化中起着关键作用。由于核糖体DNA的拷贝数因细菌种类而异，在PCR扩增阶段会出现一些错误。然而，在确定微生物群落的总体组成比例时存在已知问题。因此，它能够精确检测和定量各种微生物，为了解它们在不同条件下的人口动态提供见解。通过利用特定的遗传标记，定量PCR（qPCR）提供了对微生物群落的组成和波动的洞察，从而增强了我们对其生态和工业作用的理解。为了确认本研究中NGS分析的结果，对芽孢杆菌属、梭菌属和甲烷鬃毛菌属的指定微生物进行了qPCR。
芽孢杆菌
通过分析NGS数据中的物种水平分类，鉴定出芽孢杆菌属内两个占主导地位的分类物种为B. fumarioli（最近已转入新芽孢杆菌属）和B. flexus。根据NGS结果提供的序列，使用特异性引物对这两个物种进行绝对定量分析。
结果，B. fumarioli的拷贝数在整个第一次发酵阶段保持在较低水平。然而，在第一次添加稻草结束时（F_6），B. fumarioli的拷贝数比F_5增加了4倍。在第二次添加稻草后，它略微下降到6×1012，然后显著激增。B. fumarioli拷贝数的这种变化与第二次添加稻草后GET系统中芽孢杆菌丰度和沼气生产的动态一致。尽管第二次添加稻草后未检测到VFA，但沼气产量的显著增加归因于GET系统微生物群落中B. fumarioli种群的明显增加。因此，B. fumarioli是影响GET系统内沼气生产速率和体积的关键参与者。
另一方面，B. flexus的拷贝数比B. fumarioli低1000倍，并且在整个发酵过程中波动显著。尽管在F_6有另一个增加，但它没有超过第一次发酵阶段的最大值。其波动模式与NGS结果中观察到的芽孢杆菌变化不符。此外，由于这种拷贝数波动与沼气生产无关，B. flexus不是影响GET系统中甲烷生产的主要因素。
梭菌
已知梭菌在厌氧环境下有助于纤维素降解和酸生产。然而，使用NGS进行的微生物群落分析表明，梭菌在GET系统中的效果不如芽孢杆菌。为了确认这一点，设计了针对梭菌的特异性引物，并使用DGGE和定量PCR验证了结果。
通过分析DGGE数据中的物种水平分类，鉴定出同源性最高和较高的梭菌物种分别为C. saccharobutylicum（99.38%）和C. bowmanii（98.19%）。使用特异性引物对这两个物种进行了绝对定量分析。随后的观察显示，梭菌在三个属中拷贝数最低，且C. bowmanii的拷贝数比C. saccharobutylicum高104。C. bowmanii的拷贝数在第一次添加稻草后显示出增加的趋势，但在第二次添加稻草后，当沼气产量显著增加时，C. bowmanii的拷贝数没有增加反而下降。此外，它与VFA的变化无关。
C. saccharobutylicum的拷贝数在所测试的微生物中保持稳定，处于最低拷贝数水平，在整个实验过程中范围在106到107之间，并且与第二次添加稻草后沼气生产的中断无关。
古菌
mcrA基因（甲基辅酶M还原酶α亚基基因）编码甲基辅酶M还原酶的α亚基，该酶在产甲烷古菌的甲烷合成途径的最后一步将甲基辅酶M还原为甲烷。由于其在甲烷生产中的核心作用，mcrA基因常被用作研究环境样品中产甲烷古菌的分子标记。因此，通过定量PCR检测到的mcrA基因的丰度可以估算产甲烷古菌的活性和多样性。有趣的是，在GET系统中，NGS数据表明唯一占优势的分类属是甲烷鬃毛菌属。因此，定量PCR结果可能仅反映了甲烷鬃毛菌属的变化，尽管引物是基于mcrA基因设计的。
mcrA基因的定量分析显示，在所处理的微生物中，古菌的拷贝数在1016数量级上最高。在第一次添加稻草后，古菌的拷贝数在发酵起始阶段缓慢增加，但在F_4之后开始下降。第二次添加稻草后，这种下降持续，在F_8达到最低点，而此时沼气产量和甲烷浓度反而达到最高值，之后它反弹并稳定在2.5×1016。在GET系统的整个发酵过程中，古菌的变异范围不显著，小于两倍。特别是在第二次添加稻草后，GET系统中的甲烷浓度大幅增加，但古菌的丰度下降，表明古菌对第二次添加稻草后快速且大量的甲烷生产不负有责任。
讨论
在GET系统中，稻草以实验验证的最佳添加率（14 kg/m2）掺入稻田土壤，实现了约300 L/kg稻草的现场生物甲烷生产，甲烷浓度约为60%。GET系统的一个显著操作特征是在第二次添加稻草后沼气产量显著增加。因此，本研究聚焦于这种“第二次添加响应”，并通过分析VFA和微生物群落结构来检查相关的微生物和代谢特征。未详细讨论第三次添加后获得的数据，因为田间条件下的温度降低降低了微生物活性和沼气产量，使得与特征性的第二次添加响应进行直接比较不合适。
在第一次添加稻草后的早期阶段（F_2），VFA浓度迅速增加，这与木质纤维素底物在厌氧条件下的加速水解和酸化成一致。在厌氧消化系统中已经报道了类似的短暂VFA积累，其中植物生物质中可发酵化合物的快速释放导致VFA暂时增加。先前的研究还表明，VFA（特别是乙酸）的积累会导致酸化并抑制产甲烷活性，最终降低甲烷产率。相比之下，在GET系统中，在VFA快速积累的初始阶段，沼气生产并未受到抑制。此外，随着沼气产量的增加，VFA浓度迅速下降。这些观察结果表明，尽管底物降解进行，但产生的VFA被迅速消耗，并未在系统中积累。在此阶段，虽然随着底物消耗，总沼气产量逐渐下降，但甲烷浓度稳定在约60%。总之，这些时间序列模式表明，到F_6时，GET系统中的微生物群落已转向有利于高效生物甲烷生产的结构。
一个关键点是，在第二次添加稻草后，沼气产量在短时间内急剧增加，而VFA不再可检测到。考虑到采样分辨率和分析方法的检测限，GET系统中的VFA可能是连续产生的，但周转迅速，导致池大小低于可测量范围。因此，第二次添加稻草后，GET系统可能接近一个瞬态稳态，其中上游水解和酸生成与下游产甲烷利用高效耦合。在这种条件下，即使系统内的代谢通量很高，中间体也不预期积累到可检测浓度。
微生物群落分析表明，围绕第一次和第二次添加稻草期间的主要组成差异是芽孢杆菌的富集。尽管梭菌被广泛认为是许多消化系统中厌氧纤维素降解的重要贡献者，但GET系统中梭菌丰度的变化与观察到的VFA动态或甲烷生产模式不一致。同样，古菌丰度并未与甲烷输出平行增加；值得注意的是，古菌丰度在F_8达到最低水平，而此时甲烷产量最高。相比之下，芽孢杆菌丰度的变化与甲烷生产动态更一致。
土壤细菌已发展出各种策略来适应土壤环境的变化。降雨或浇水后，半径大于3毫米的土壤团聚体成为无氧的厌氧环境。在这种厌氧条件下，氧气被不同的电子受体（如硝酸盐）所取代，CO2是其中之一，以产生能量。
长期以来被认为是需氧菌的芽孢杆菌，在厌氧环境中也可以利用各种电子受体代替氧气。此外，关于芽孢杆菌菌株在厌氧发酵中的作用，它们通过产生多种酶（如蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶）在各种生物质的生物降解中发挥重要作用，这些酶已应用于各种工业过程。随后，芽孢杆菌通过发酵各种底物生产乙醇、丁醇和其他生物燃料。此外，在厌氧发酵中，已知枯草芽孢杆菌通过两步反应从乙酰辅酶A生产乙酸，同时在第二步生物合成ATP。根据B. fumarioli的全基因组分析，B. fumarioli拥有两个关键酶，即磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶，涉及从乙酰辅酶A到乙酸的厌氧发酵，表明B. fumarioli在从稻草生产乙酸方面发挥着与枯草芽孢杆菌和梭菌物种相同的作用。
在B. fumarioli中，乙酸可能被分泌到细胞外，因为其消耗有助于维持细胞内pH和控制微生物群落。在GET系统下的厌氧微生物群落中，甲烷鬃毛菌属可能利用那些乙酸作为甲烷发酵的底物。B. fumarioli和甲烷鬃毛菌属的拷贝数分别为1013和1016，表明甲烷鬃毛菌属的丰度高出1000倍。因此，未检测到VFA的原因是由于B. fumarioli的乙酸产量和甲烷鬃毛菌属的乙酸消耗之间的差异，这是由B. fumarioli和甲烷鬃毛菌属之间的拷贝数差异引起的。
总之，本研究获得的结果表明GET系统的高沼气生产（300 L/kg稻草）如下：
（1）未检测到沼气生产所必需的VFA，如乙酸。
（2）微生物群落结构分析显示，芽孢杆菌比梭菌占优势。
（3）在古菌中，甲烷鬃毛菌属占优势。
（4）定量实时PCR结果显示，沼气产量的增加与B. fumarioli的拷贝数同步。
（5）甲烷鬃毛菌属的拷贝数最高，是B. fumarioli的1000倍。此外，基于现有知识，关于本研究中鉴定的B. fumarioli，以下几点是明确的：
（6）芽孢杆菌可以在厌氧环境下生物合成乙酸。
（7）B. fumarioli的全基因组分析显示，它拥有能够生物合成乙酸的基因簇。
基于全面和综合的知识，GET系统高沼气生产的特征总结如图5所示。
GET系统是一项创新技术，不仅减少了稻田的甲烷排放，而且仅用橡胶板和气体收集袋为可再生能源生产做出了贡献。B. fumarioli的丰度成为确认GET系统中甲烷发酵过程是否正常工作的关键生物标志物。因此，对B. fumarioli的进一步研究不仅将为厌氧代谢调控机制的基础研究铺平重要道路，而且还将为应用研究（如促进可再生能源和发现用于回收纤维素废弃物的新酶）开辟重要途径。
