靶向聚合免疫球蛋白受体的单域抗体解锁粘膜富集新策略：增强IgG抗呼吸道合胞病毒能力

《Frontiers in Immunology》：Unlocking binding properties of single-domain antibodies targeting the polymeric immunoglobulin receptor to enhance mucosal enrichment of IgG against respiratory syncytial virus

本篇研究聚焦于克服IgG抗体在粘膜部位富集不足的瓶颈，通过发现靶向聚合免疫球蛋白受体(pIgR)的骆驼源单域抗体(VHH)，成功构建了能高效进行跨上皮细胞转运的双特异性抗体(bsAb)，在保留对呼吸道合胞病毒(RSV)强效中和活性的同时，显著提升了其在人呼吸道粘膜模型中的分布水平，为开发针对粘膜病原体的新一代抗体疗法提供了创新思路。

　　

引言

粘膜屏障是人体防御外部病原体的第一道防线，而免疫球蛋白A(IgA)是粘膜免疫的关键效应分子，它能通过聚合免疫球蛋白受体(pIgR)介导的跨细胞转运(Transcytosis)过程，从组织侧被主动运输到管腔侧的粘膜分泌物中。然而，IgA在治疗应用上面临生产挑战和体内半衰期短的局限。相比之下，免疫球蛋白G(IgG)因其成熟的生物学特性和生产工艺，已成为治疗性抗体开发的首选，但IgG缺乏对pIgR的天然亲和力，导致其在粘膜部位的浓度相对较低。因此，如何增强IgG的粘膜递送是开发针对呼吸道感染等疾病的有效抗体的核心挑战。本研究旨在开发能够靶向pIgR并促进IgG跨粘膜转运的新型递送策略。

靶向pIgR的单域(V_HH)抗体的产生与表征

研究团队以棉鼠(Sigmodon hispidus)的pIgR重组蛋白免疫羊驼，通过荧光激活细胞分选(FACS)和酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选，获得了45个独特的抗pIgR V_HH序列，并将其表达为与人IgG1 Fc结构域融合的蛋白(V_HH-hFc)。通过表面等离子共振(SPR)分析，这些分子与棉鼠pIgR胞外域(ECD)的结合亲和力(K_D)范围在16 pM到200 nM之间。进一步的表位分组分析和结构域映射显示，这些抗体可靶向pIgR的多个胞外结构域（D1, D2, D3, D4-5），并划分为6个不重叠的表位组。

抗pIgR V_HH-hFc分子在pIgR-MDCK细胞中的转运活性

为了评估抗pIgR V_HH-hFc分子的转运活性，研究使用了表达棉鼠pIgR的MDCK细胞(cpIgR-MDCK)单层模型。在43个测试分子中，大部分能被有效转运，其中两个分子VHH1和VHH34表现出与pIgR的天然配体二聚体IgA(dIgA)相当的的高效转运活性。有趣的是，将抗体按结合的结构域分组后，不同结构域结合组之间的转运活性相似，这表明靶向pIgR的不同胞外结构域均可实现有效转运，转运效率与结合结构域没有强相关性。

结合动力学与转运活性之间的关系

利用靶向pIgR D1结构域同一表位组但具有不同亲和力的V_HH-hFc分子面板，研究深入探讨了结合特性与转运活性的关系。研究发现，结合亲和力(K_D)大于10 nM的抗体，其顶端转运的抗体浓度比K_D小于1 nM的抗体高约1.5倍。进一步分析显示，转运活性与解离速率(k_off)呈正相关，即转运能力强的抗体往往具有更快的解离速率。此外，在高效转运的抗体中（如VHH1, VHH32等），有五个克隆虽然具有小于5 nM的高亲和力，但同样表现出高效的转运。对这些克隆的pH依赖性结合分析发现，它们在酸性pH（模拟内体环境）条件下的亲和力显著下降，这主要是由于解离速率增加了10至20倍。这表明pH依赖性结合（即在酸性环境下更容易从受体上解离）可能是促进某些抗pIgR抗体进行有效转运的一个因素。

靶向RSV和pIgR的双特异性抗体的设计、生成与表征

基于以上发现，研究的目标是构建一个双功能双特异性抗体(bsAb)，使其既能高效中和RSV，又能通过pIgR介导的途径有效穿过粘膜屏障。研究选择了靶向RSV融合(F)糖蛋白的高效中和IgG作为骨架，将筛选出的顶级抗pIgR V_HH克隆（VHH1）通过一个(G₄S)₂连接子融合到该IgG重链的C末端，形成了一种2x2格式（即对两个靶点均为双价结合）的双特异性抗体，称为IgG-V2。该bsAb在表达系统中成功表达并纯化，质谱分析证实了其结构完整性。

结合表征结果显示，bsAb保留了与亲本抗pIgR V_HH-hFc分子相当的、对棉鼠、人和小鼠pIgR的细胞结合能力与亲和力。同时，其对RSV F蛋白的结合亲和力也保持在皮摩尔级别，与亲本抗RSV IgG相当，表明融合抗pIgR V_HH结构域并未影响其对两个靶点的结合能力。

RSV/pIgR双特异性抗体的转运与中和功能

接下来，研究评估了bsAb是否保留了转运功能。在cpIgR-MDCK细胞模型中的转运实验表明，bsAb中融合的抗pIgR V_HH结构域能够介导与亲本V_HH-hFc分子水平相似的转运效率。重要的是，使用RSV F蛋白作为捕获试剂对顶端腔室中的抗体进行定量，也得到了一致的结果，这证明在转运后，bsAb中的抗RSV IgG部分仍保持完整的抗原结合能力。病毒中和实验进一步证实，bsAb具有与亲本抗RSV IgG同等强效的RSV中和活性，其半数抑制浓度(IC₅₀)为0.5 nM。

RSV/pIgR双特异性抗体在人原代气-液界面模型中的转运活性及其体内药代动力学

为了在更接近人体生理的环境中验证bsAb的粘膜递送潜力，研究使用了由人原代支气管上皮细胞(HBECs)分化形成的气-液界面(ALI)模型。该模型能形成具有纤毛和粘液分泌功能的假复层上皮。qPCR分析证实该模型稳定表达人pIgR。转运实验显示，无论是单特异性的抗pIgR V_HH-hFc还是RSV/pIgR bsAb，在ALI模型的顶端粘液中的浓度均显著高于不靶向pIgR的亲本抗RSV IgG，甚至达到了dIgA转运水平的两倍。这表明抗pIgR V_HH作为穿梭分子，能有效引导抗体分布到人呼吸道管腔。

然而，在棉大鼠体内的药代动力学(PK)研究显示，肌肉注射给药的RSV/pIgR bsAb血清浓度极低，而静脉注射给药的多个抗pIgR V_HH-hFc分子在野生型小鼠中也表现出快速的血清清除。这种快速的清除很可能与pIgR介导的、在粘膜组织中的主动转运和清除有关，即靶点介导的药物处置(TMDD)效应。研究也指出，啮齿动物肝脏中pIgR的高表达可能加剧了这种清除，这提示物种差异在将临床前数据外推至人体时需要被谨慎考虑。

讨论

本研究成功开发了一组能够有效促进pIgR介导的跨粘膜转运的抗pIgR单域抗体(V_HH)，并利用其中的先导克隆构建了靶向RSV和pIgR的双特异性抗体(bsAb)。该bsAb在体外上皮细胞模型和人原代呼吸道模型中均展现出高效的转运能力，并完全保留了抗RSV IgG的中和效力。研究发现，抗pIgR抗体的转运效率与其结合亲和力和解离动力学相关，较低亲和力（主要由较快解离速率驱动）以及pH依赖性的结合可能有利于抗体在内体酸性环境中从pIgR上解离，从而被分选进入转运途径而非降解途径。这些发现为理性设计具有优化粘膜递送特性的抗体疗法提供了重要见解。尽管在啮齿动物模型中观察到了因pIgR介导的主动清除而导致的快速血清清除，这可能限制了系统暴露，但也恰恰反证了其对pIgR阳性粘膜组织的高效靶向能力。未来需要在与人类更具生理相关性的模型（如非人灵长类）中进一步评估其药代动力学、粘膜富集效果和安全性，以推动该策略向临床应用转化。总之，该研究提出了一种通过工程化改造抗体、利用pIgR转运系统来增强治疗性IgG在呼吸道粘膜分布的新颖策略，为应对RSV等粘膜病原体感染提供了有前景的解决方案。