《Journal of Advanced Research》：An increase in DNA methylation contributes to anthocyanin biosynthesis in the pericarp as litchi (
Litchi chinensis Sonn.) fruit ripens
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本文旨在解决荔枝果皮褐变机制不清、采后保鲜技术缺乏理论指导的关键产业问题。研究人员围绕荔枝果实成熟和衰老过程中DNA甲基化修饰的动态变化及其调控花青素合成的分子机制展开深入研究。结果表明，DNA去甲基化酶基因LcDML1表达下调导致全基因组DNA甲基化水平在成熟期升高，并通过抑制花青素合成负调节因子（NRAs）的表达，间接促进花青素积累和果皮转色。该研究首次系统揭示了DNA甲基化在调控荔枝果实成熟和色泽形成中的关键作用，为利用表观遗传手段精准调控果实成熟、延缓采后品质劣变提供了新思路。
荔枝，这种原产于中国的亚热带水果，以其鲜艳的红色果皮和清甜的口感深受人们喜爱。然而，这份美丽与美味却十分“脆弱”。果实一旦采摘，果皮极易发生褐变和腐烂，这成为制约荔枝长途运输和市场销售的最大瓶颈。果皮的颜色变化，尤其是其标志性的红色，主要来源于一类名为花青素的天然色素。那么，究竟是什么在幕后精准指挥着荔枝果皮中花青素的合成与积累，从而影响着它的“颜值”与货架期呢？传统的认知聚焦于基因的转录水平调控，但近年来，科学家们发现，超越DNA序列本身的表观遗传修饰，例如DNA甲基化，在植物生长发育和逆境响应中扮演着“开关”角色。在番茄、草莓、柑橘等多种果实中，DNA甲基化的动态变化已被证实与成熟过程密切相关。然而，在荔枝这种重要的经济作物中，全基因组范围内的DNA甲基化如何变化？它是否以及如何调控果实的成熟，特别是决定商品外观的关键性状——果皮色泽？这些问题此前仍是一片空白。为了破解这些谜题，并为荔枝采后保鲜提供新的理论武器，一项聚焦于荔枝果实DNA甲基化图谱的研究应运而生。相关成果已发表在《Journal of Advanced Research》上。
研究人员为阐明DNA甲基化在荔枝果实成熟和衰老中的作用，综合运用了多项关键组学与分子生物学技术。研究以荔枝品种“怀枝”为材料，在五个关键发育期（56、70、84天及采后2、6天）采集果皮样本。核心技术包括：利用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）绘制了单碱基分辨率的DNA甲基化图谱；通过RNA测序（RNA-seq）分析转录组变化；结合生物信息学手段进行差异甲基化区域（DMRs）和差异表达基因（DEGs）的关联分析。在功能验证层面，研究采用了DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷（5′-Aza）进行外源处理，并利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术构建了LcDML1基因沉默株系。此外，还通过甲基化敏感PCR（McrBC-PCR）、双荧光素酶报告基因（DLR）检测、高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）以及实时定量PCR（RT-qPCR）等技术，从多个维度验证了DNA甲基化对花青素合成通路的调控机制。
研究结果
荔枝果实成熟过程中果皮DNA甲基化组特征
通过对五个发育阶段的果皮进行WGBS测序，研究人员成功构建了高精度的DNA甲基化图谱。分析发现，荔枝基因组中约有55%的CG位点、34%的CHG位点和11%的CHH位点被甲基化。从绿熟期（56 DAA）到采后褐变初期（2 DAP），全基因组DNA甲基化水平持续升高，随后在深度褐变期（6 DAP）略有下降。这种全局性甲基化的增加主要由CHH序列上下文（context）的甲基化水平升高所驱动。此外，高甲基化区域主要集中在端粒和着丝粒周围等基因密度低、转座元件（TEs）富集的区域。
全基因组DNA甲基化水平在荔枝果实成熟期升高
通过差异甲基化胞嘧啶（DMCs）和差异甲基化区域（DMRs）的进一步分析证实，在果实成熟阶段（从56 DAA到0 DAP），高甲基化的DMCs和DMRs数量均多于低甲基化的数量，尤其是在CHH类型中更为显著。对鉴定出的高甲基化DMRs的分析显示，其甲基化水平在成熟过程中持续增加，而在衰老期波动。这些DMRs相关基因（DMGs）的功能富集分析表明，它们显著富集于次级代谢物生物合成、类黄酮生物合成和苯丙氨酸代谢等重要通路，提示DNA甲基化可能参与了荔枝成熟过程中的色泽形成。
DNA甲基化与荔枝果实成熟过程中花青素生物合成的关联
整合WGBS和RNA-seq数据的分析发现，在成熟阶段，DNA甲基化对基因表达的影响远大于衰老阶段。共有1526个基因在成熟阶段既是DMG又是DEG，这些基因同样富集于类黄酮和苯丙烷代谢通路。基因表达与甲基化模式的关系分析揭示，启动子区域较高的CHH甲基化与基因高表达呈正相关，而基因上下游区域（特别是CG和CHG上下文）的高甲基化则与基因低表达或沉默相关。使用DNA甲基化抑制剂5′-Aza处理绿熟期果实，显著抑制了果皮转红，并降低了两种主要花青素（矢车菊素-3-O-芸香糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷）的含量及多个花青素合成相关基因（ASGs）的表达。然而，大部分ASGs的表达趋势与其启动子区DNA甲基化水平并未呈现简单的负相关，暗示DNA甲基化可能通过间接方式调控该通路。
沉默LcDML1加速荔枝果实成熟过程中果皮花青素生物合成
为了寻找驱动全基因组DNA甲基化变化的关键因子，研究人员鉴定了荔枝中的DNA甲基转移酶和去甲基化酶基因。表达模式分析显示，在成熟期，多个DNA甲基转移酶基因及RNA导向的DNA甲基化（RdDM）通路关键基因表达下调，而去甲基化酶基因LcDML1（ROS1的同源基因）的表达也持续下降。相关性分析发现，LcDML1的表达与全基因组DNA甲基化水平呈极显著的负相关。通过VIGS技术沉默LcDML1>后，荔枝果皮提前转红，花青素含量增加，多个ASGs的表达显著上调。这证明LcDML1介导的DNA去甲基化过程在抑制荔枝果实过早成熟和色泽形成中起着关键作用。
DNA甲基化与花青素生物合成负调节因子（NRAs）基因表达的相关性
鉴于DNA甲基化与ASGs的直接关联不强，研究人员将目光投向了花青素合成的负调节因子（NRAs）。他们在荔枝基因组中鉴定了28个NRAs，包括已验证的LcFLS和LcMYBX以及其他转录因子。分析发现，多个NRAs（如LcTCP15-2、LcGL2-3等）的启动子区域DNA甲基化水平在果实成熟关键期显著升高，而其基因表达则相应下降。McrBC-PCR实验证实了这些启动子的高甲基化状态。5′-Aza处理会上调部分NRAs的表达，而沉默LcDML1则会下调这些基因。双荧光素酶报告实验进一步证明，LcCPC-1、LcLBD37-1/2、LcTCP15-2、LcGL2-3和LcSPL9等NRAs能够抑制LcDFR、LcUFGT和LcGST等ASGs启动子的活性。这表明，LcDML1沉默导致的全局DNA甲基化升高，通过超甲基化并抑制NRAs的表达，解除了后者对ASGs的抑制，从而促进了花青素的积累。
研究结论与意义
本研究系统阐明了DNA甲基化动态调控荔枝果实成熟和果皮色泽形成的新机制。核心结论是：在荔枝果实成熟过程中，DNA去甲基化酶基因LcDML1表达的持续下调，导致了全基因组DNA甲基化水平的升高。这种全局性的表观遗传变化，并非直接激活花青素合成基因，而是通过特异地增加花青素合成负调节因子（NRAs）启动子区域的甲基化水平，抑制了NRAs的转录。NRAs表达的降低，进而解除其对花青素合成通路的结构基因和转录因子的抑制作用，最终驱动花青素大量合成和果皮转红。同时，部分花青素合成基因（如LcUFGT）启动子也发生去甲基化，共同精细调控色泽形成。
该研究的重要意义在于：首先，首次在荔枝中绘制了果实成熟与衰老过程的单碱基分辨率DNA甲基化图谱，填补了该领域的研究空白。其次，创新性地揭示了DNA甲基化通过调控“负调节因子”这一间接路径来影响花青素合成和果实成熟的新模型，深化了对表观遗传调控果实品质复杂性的理解。最后，鉴定出的关键基因LcDML1为后续通过基因工程或表观遗传育种手段，精准调控荔枝乃至其他果实的成熟时间、改善色泽、延缓采后劣变提供了重要的候选靶点，具有重要的理论价值和应用前景。
