《New Phytologist》：In perennial Arabis alpina, CONSTANS and FLOWERING LOCUS T have common and distinct effects on flowering and inflorescence architecture
Summary
在多年生高山南芥（Arabis alpina）中，初级枝条和腋生枝条的开花受到差异性调控。尽管春化作用和衰老途径的贡献已被分析，但光周期开花基因CONSTANS（CO）、FLOWERING LOCUS T（FT）和TWIN-SISTER OF FT（TSF）的作用仍未探索。本研究通过CRISPR-Cas9技术获得了AaCO和AaFT/TWIN SISTER OF FT-LIKE（TSFL）的突变，并在pep1背景中对Aaco和Aaft/tsfl突变体在长日照（LD）或短日照（SD）以及春化处理后的开花时间、花序分枝和花表型进行了评估。通过比较初级枝和腋生枝的RNA-seq数据，发现AaCO在叶片中激活AaFT/TSFL的转录，Aaco和Aaft tsfl突变在LDs下延迟开花。Aaco突变体的腋生枝能开花，而Aaft tsfl突变体的腋生枝则不能。两种突变体在LDs下的初级枝条都缺乏花序分枝和花。然而，Aaft tsfl突变体在春化后能产生一些花，Aaco在SDs下也能产生少量花。RNA-seq鉴定出了在初级枝条和腋生枝中响应AaFT、TSFL和AaCO的基因。因此，AaCO-AaFT促进A. alpina在LDs下开花，但在腋生枝开花中具有独特作用。这两个基因都是初级枝条上花序分枝和花形成所必需的。CO-FT模块在花序结构中的复杂作用可能是A. alpina多果、多年生生活史的基础。
Introduction
被子植物的繁殖策略具有高度可变性，其生活史可能是一年生、二年生或多年生的。大多数被子植物物种是多年生的，但一年生植物已多次独立进化。这些生活周期的差异对植物的生态学和竞争力具有深远影响，并且在很大程度上取决于分生组织命运的变异。一年生植物如拟南芥（Arabidopsis thaliana）经历快速的、单季节生长，茎顶端分生组织（SAM）和腋生分生组织（AMs）转变为生殖生长。然后植物结实并衰老，所有分生组织被消耗。相比之下，多年生植物如高山南芥（Arabis alpina）可存活数年，在营养期和生殖期之间交替。一些AMs保持营养生长状态，而另一些则经历花转变，营养枝进入休眠以再生新的生长。十字花科已成为理解生活史多样化遗传学的模型，因为姐妹一年生和多年生物种已独立进化多次。
十字花科植物生活周期差异的基础在于MADS结构域家族中的开花抑制因子，特别是在与FLOWERING LOCUS C（FLC）相关的支系中。在拟南芥中，FLC赋予对冬季寒冷（春化）的开花响应。低温暴露使FLC转录沉默，并且通过FLC基因座处稳定的组蛋白修饰，这种抑制在回归温暖条件后仍持续存在。FLC的稳定抑制使得SAM和所有AMs形成花，导致种子产生。在多年生A. alpina中，FLC直系同源基因PERPETUAL FLOWERING 1（PEP1）在春化期间被抑制，允许所有分生组织发生花转变。然而，在回归温暖后，PEP1的转录被重新激活，维持尚未经历花转变的分生组织处于营养状态。在A. alpina和其他几种十字花科物种中，FLC直系同源基因的突变导致连续开花，即所有AMs独立于春化而开花。与FLC相关的MADS AFFECTING FLOWERING（MAF）家族基因以及相关的FLOWERING LOCUS M（FLM）或MAF-RELATED（MAR）家族也有助于十字花科多年生植物中开花的抑制，并且可能与FLC直系同源基因完全冗余。
除了春化作用，其他环境和发育信号通过一个优化繁殖时间的通路网络控制拟南芥中的花转变。 among these pathways is one involving the SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) transcription factors, which are negatively regulated by miR156. MIR156 genes的转录在老株中被抑制，允许SPLs表达，因此，该通路被认为是与年龄相关的开花途径。SPL15受到miR156的负调控，并且也被FLC转录抑制，使其成为年龄相关和春化途径的关键汇聚点。在多年生物种中，这种相互作用使得对春化的开花响应具有年龄依赖性。
与春化和衰老相反，光周期途径在调节A. alpina及相关多年生植物花转变中的作用仍未得到充分探索。这种广泛保守的途径在使开花与波动的日长同步方面很重要，并且可能是理解A. alpina如何在其高海拔或高纬度栖息地最大化其繁殖成功的关键。拟南芥和许多其他十字花科物种是兼性长日（LD）植物，当在每个24小时周期内暴露于长光周期时开花更早。拟南芥暴露于长光周期导致CONSTANS（CO）基因转录增加以及其编码的B-box转录因子的稳定。CO然后激活韧皮部伴细胞中FT及其旁系同源基因TWIN SISTER OF FT（TSF）的转录。FT成花素蛋白通过韧皮部运输到SAM，在那里启动花转变。在非诱导性短日（SD）下，开花通过SPL转录因子的活性独立于CO-FT模块发生。CO和FT直系同源基因在草本多年生植物中的作用尚未被详细研究。然而，FT基因与拟南芥的多年生亲属lyrate arabidopsis的开花控制、林地黄莓的花序发育以及多年生树木芽休眠的调节有关。
我们研究了CO-FT调节模块在模型多年生植物A. alpina开花中的功能。利用CRISPR-Cas9，我们在A. alpina的CO和FT/TSF基因中产生了突变，并在pep1突变背景中分析了它们的效果。我们发现FT或CO基因的突变强烈延迟开花，但对初级枝条（PS）上的花序发育有意想不到的强烈影响，使得突变体未能形成花序分枝（花序阶段1，I1）或花（花序阶段2，I2）。此外，我们发现，在叶腋处形成的腋生枝（ABs，V1）上，Aaco pep1突变体开花，而Aaft tsfls pep1突变体在这些ABs上不形成花。我们讨论了这些基因对A. alpina多年生生活史的影响。
Materials and Methods
Synteny and phylogenetic analyses
进行了同线性分析以研究多个Arabis物种和拟南芥之间基因的基因组组织和保守性。使用Pac-Bio长读长、双末端测序生成了高山南芥（Arabis alpina）材料的基因组序列数据。所有获得的读数使用已发表的Pajares参考基因组进行比对。从Arabis物种和拟南芥的基因组序列中检索目标基因的基因组序列。首先使用Blast重新分析序列并将其比对到各自的基因组。仔细验证并必要时调整基因模型以确保正确比对。使用R中ggplot2包的自定义脚本通过比较物种间的保守区域来识别同线性块。此外，考虑到Arabis中常见的基因复制，在比对过程中允许重复比对以确保捕获所有相关的旁系同源基因。AaFT基因先前被称为AaFT1至AaFT4；然而，基于此处的同线性分析，它们被重命名为AaFT、TSFL1、TSFL2和TSFL3。
使用AaCO、AaFT和TSFLs的蛋白质序列构建了系统发育树。使用默认参数的MUSCLE算法比对氨基酸序列。使用MEGA11中实施的Maximum Likelihood方法构建系统发育树，应用LG替代模型，该模型因其在蛋白质序列进化方面的性能而被选择。通过100次bootstrap重复评估树拓扑的统计支持。
Gene expression analysis
在LD和SD条件下生长的植株完全展开的第五片叶上进行昼夜基因表达分析。对于每种基因型，在LD下每2小时、SD下每3小时收集三个生物学重复。使用RNeasy kit提取总RNA，并使用Turbo DNAse kit处理1 μg总RNA。使用oligo(dT)18引物和Superscript II逆转录酶按照制造商说明进行cDNA合成。使用BioRad iQ5 apparatus和SYBR Green I detection进行定量实时RT-PCR，使用2 μl cDNA:H2O的1:10稀释液。使用Arabis alpina PROTEIN PHOSPHATASE 2A（AaPP2A）作为参考基因标准化表达数据。使用2?ΔΔCt方法确定相对基因表达。
通过在LD或SD条件下生长的植株的叶片、花和长角果的RNA进行qRT-PCR分析AaFT、TSFL和AaCO基因表达的组织特异性。在各自生长条件下萌发后5周进行转移实验。进行时间序列实验，分别在LD的ZT16和SD的ZT8时间点每周（LD）或每两周（SD）收获叶片样本。每周收获一个新完全形成的叶片用于测量mRNA表达。从经过春化的植株上收获花和长角果。收获最先开放的两朵完全开放的花和授粉后6天的幼嫩长角果用于RNA分离。
Plant material and growth conditions
使用多年生西班牙高山南芥材料“Pajares”来分析光周期途径基因的表达。为了产生CRISPR-Cas9突变系，使用pep1突变植株，因为它们从所有分生组织持续开花，导致形成更多的花，从而提高了转化效率。此外，我们使用pep1背景来研究光周期对独立于春化在所有ABs上产生花的A. alpina植株的影响。种子在4°C黑暗中层积3天，植株在可控温室条件或生长箱中生长，分别在SD（8小时光照:16小时黑暗）或LD（16小时光照:8小时黑暗）下，光强为200至500 μmol m?2s?1，温度22°C。植株在4°C、光强14 μmol m?2s?1的生长箱中在LD或SD下进行春化。从萌发开始计算到第一朵花开放的天数（DTFO）。表型分析使用5到15株植株。
Confocal imaging of shoot apical meristems in pep1 background
从在不同条件下生长的植株收获SAMs。每个时间点每个基因型分析三个分生组织。在冰上收获顶端分生组织，并用4%多聚甲醛的PBS溶液通过真空渗透三次，每次10分钟进行固定。然后将样品在黑暗中孵育过夜，并用PBS缓冲液洗涤两次，每次10分钟。使用ClearSee澄清组织直至透明。将SCRI Renaissance 2200细胞壁特异性标记物添加到ClearSee溶液中，并将样品在室温下黑暗保存直至成像。使用Leica SP8共聚焦显微镜获取具有z-stack间隔的共聚焦图像。
Cloning and generation of CRISPR-Cas9 lines
使用两个靶位点敲除A. alpina中的AaFT以及TSFL1、TSFL2和TSFL3基因。靶点1（5′-ACGGATATTCCTGCCACAAC-3′）特异性针对AaFT的外显子3，靶点2（5′-AGTCCAAGCAACCCTTACC-3′）在TSFL1、TSFL2和TSFL3的外显子2中保守。对于AaCO，使用了外显子1中的两个靶位点（5′-CGAGTCATGTGAGCGTGCCC-3′和5′-CGAGACAACAATGACCAATC-3′）。按照所述方法克隆guide RNAs。将最终的双元质粒克隆到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101（pSOUP）中。通过pep1植株的花序浸渍转化后，在含有不含蔗糖的MS培养基和100 mg ml?1潮霉素的固体琼脂平板上筛选T0种子。根据更长的下胚轴和根选择阳性转化体，并移栽到土壤中。通过PCR验证转化体中外源基因的存在。为了鉴定基因编辑，用基因特异性引物扩增基因，并将得到的PCR扩增产物克隆到pGEM-T载体中，并通过Sanger测序进行测序。
Propagation of CRISPR-Cas9-edited plants
用AaFT-TSFL-sgRNA-Cas9-Hyg cassette转化在pep1背景中产生了28个T1代转化体，对每个转化体中的AaFT和TSFL基因测序揭示了Aaft和tsfl突变的各种组合。T1植株的自花授粉导致T2代中出现各种突变基因型， either through segregation of edited alleles identified in the T1or the identification of newly edited alleles。选择突变体通过后续世代繁殖，直到目标突变纯合。类似地，当使用AaCO-sgRNA-Cas9-Hyg cassette转化时，获得了10个T1代转化体。选择两个具有移码缺失的突变体进行进一步分析。这些植株自花授粉产生T2和T3代，然后用于表型分析。
Transcriptome analysis of Aaco and Aaft tsfl mutants
在时间序列上对在LDs下生长的植株材料进行RNA-seq分析，并在ZT16收获组织。在每个时间点收获SAMs和AMs用于RNA测序分析。在立体显微镜下切除富含SAM的顶端组织，并去除可见的叶原基。从BGI Poland获得了总共约每样本2000万条100 bp双末端读长。使用Galaxy处理原始测序数据。使用STAR将读数比对到A. alpina参考基因组，并使用FeatureCounts生成基因水平计数。使用DESeq2中位数比率法进行标准化，该方法校正了样本间测序深度和RNA组成的差异。使用DESeq2 Wald检验进行差异基因表达分析，以计算每个基因的log2FC和相关P值。使用Benjamini–Hochberg错误发现率校正对P值进行多重检验校正以控制I类错误。
使用ClusterProfiler进行Gene Ontology（GO） term富集分析，重点关注具有拟南芥注释的生物学过程术语。为了减少富集GO terms之间的冗余，使用rrvgo进行基于语义相似性的聚类。
Statistical analysis
为了最小化表型可塑性，将植株随机分配到温室舱室中。数据表示为来自三到五个独立生物学重复的平均值±SD，具体取决于实验类型。使用单因素ANOVA评估不同组平均值之间的统计显著性，然后进行Tukey事后检验或Wilcoxon检验。差异在，P < 0.05时认为显著，在，P < 0.01时高度显著，在**，P < 0.001时非常高度显著。使用R Studio生成图表用于分析和绘图。
Results
Flowering response to daylength in perennial Arabis alpina correlates with transcription of CO-FT genes
使用充分表征的西班牙材料Pajares研究草本多年生植物A. alpina中的CO-FT模块。在A. alpina染色体8上鉴定了一个CO同源基因，其侧翼是拟南芥中CO邻近基因的直系同源基因（At5G15830和AT5G15850（AtCOL1））。系统发育分析证实它与AtCO的关系比与其他AtCOL蛋白的关系更近，支持其作为AtCO直系同源基因的身份。此外，鉴定了四个FT同源基因。其中一个基因AaFT与拟南芥的FT和FAS1具有同线性保守性，并且先前被命名为AaFT1。然而，其他三个基因与FT或其旁系同源基因TSF没有显示出同线性保守性。对拟南芥的FT和TSF蛋白序列以及在高山南芥材料和相关物种中鉴定出的FT同源物蛋白序列进行了系统发育分析。该分析表明AaFT与FT存在于同一支系中，与同线性保守性一致。然而，其余三个蛋白与拟南芥的TSF关系更近。因此，我们将相应的基因命名为TWIN SISTER OF FT-LIKE（TSFL1）、TSFL2和TSFL3。FT和TSFL2亚支包含所有Arabis物种的蛋白。然而，TSFL1仅在A. alpina材料中发现，表明它可能是在A. alpina谱系中通过复制相对较近期产生的。
然后研究了需要春化才能开花的A. alpina材料Pajares及其不依赖春化开花的突变体pep1的光周期开花响应。两种基因型在22°C的LD下生长5周，然后在4°C下进行12周SD春化，然后返回22°C的LD。Pajares在返回22°C的LD后2周形成可见的花蕾，而pep1在返回相同条件时已经具有花蕾。然后将两种基因型的10周龄植株在连续SDs下生长，并暴露于春化12周。Pajares在PS上形成可见的花蕾，但这些花蕾在返回温暖SDs后10周未能进一步发育。此外，即使在返回温暖SDs后10周，Pajares也未在AB（V1）上形成任何花蕾。相比之下，pep1植株在返回温暖SDs后5周内在PS上开花，但随后在形成更多花之前逆转形成叶，最终枝条终止于一个花蕾。为了解耦春化和光周期效应，将pep1植株在连续LD和SD条件下生长。植株在LDs下比在SDs下开花早，并且在SDs下，PS的结构显示休眠芽、营养枝，并终止于少数几朵花。在LDs下，pep1植株形成最终开花的V1分枝，随后是I1分枝，然后是PS上的单生花。然而，在SDs下，pep1突变体产生更多的V1分枝。这些之后是几个含有休眠芽的节，然后是苞片支撑的花和少数单生花。休眠芽出现在预期形成腋生I1分枝的位置，并且在SDs下没有I1分枝发育。在春化前后在连续SDs下生长的Pajares植株中，花转变不完全，植株显示败育的花蕾。这些发现表明A. alpina是一种兼性LD植物，并且光周期对开花时间和花序发育都有强烈影响。
为了进一步剖析光周期对开花的控制，在光周期结束时（LDs为ZT16，SDs为ZT8）测量了叶片中AaCO和AaFT/TSFL mRNA水平，植株在模拟自然条件下生长（5周LD 22°C → 12周SD 4°C → LD 22°C）。RT-qPCR分析显示，AaFT mRNA水平在LDs下相对较高，而TSFL基因在相同条件下表达水平较低。相比之下，在SDs 4°C下，年幼（L17）和年老（L1）叶片中AaFT/TSFL2 mRNA的丰度极低。返回LD，22°C后，春化后新形成的（L20）和已形成的（L1）叶片中AaCO、AaFT和TSFL2的表达增加，与花转变和花序发育相关。为了进一步验证在SD 4°C下AaCO/AaFT/TSFLs表达的降低，进行了转移实验，保持恒定的发育生长周期。植株在22°C的SDs下生长5周，然后转移到4°C，在SDs或LDs下进行春化。仅在暴露于LD条件的植株叶片中AaCO和AaFT的表达增加。这一结果与先前检测到的SDs下的低表达水平一致。除了这些实验，使用pep1植株在连续LD条件下测量表达谱，因为我们使用该基因型产生CRISPR突变体。在连续LDs下，表达谱与LD寒冷实验中观察到的相似。与这一结果一致，pep1在LDs下比在SDs下开花早。
AaCO and AaFT TSFLs all promote photoperiodic flowering but have different effects on inflorescence development in the primary and axillary shoots in the pep1 background
为了对AaCO-AaFT/TSFL模块进行遗传鉴定，在pep1背景中创建了AaCO、AaFT和TSFLs的CRISPR-Cas9诱导突变。回收了两个Aaco突变体，分别包含8-bp缺失或1-bp插入，称为Aaco-1 pep1和Aaco-2 pep1。表型分析显示，在LDs下，两个Aaco pep1突变体都比pep1开花晚，并且仅从V1 ABs开花。在PS上，Aaco pep1突变体从未产生典型的I1分枝或pep1花序特有的单生花。这种表型表明PS的开花比V1 ABs的开花更依赖于涉及AaCO的调节途径。为了研究AaCO对PS和V1 ABs的差异效应是否由AaFT和TSFL介导，回收了这些基因的突变。在T1代转化体中获得了三个五重突变体（Aaft tsfl1 tsfl2 tsfl3 pep1（以下简称Aaft tsfls-1 pep1至Aaft tsfls-3 pep1））。这些突变体不形成花，但在预期I1节的位置形成休眠芽，如在LDs下的Aaco pep1突变体和SDs下的pep1中所观察到的。pep1和Aaft tsfls-1 pep1突变体在6周时的SAM的共聚焦成像显示，pep1突变体已经形成花原基，但Aaft tsfls-1 pep1的SAM仍然是营养性的。到28周时，许多pep1突变体的花序已经衰老，但Aaft tsfls-1 pep1五重突变体继续形成营养叶直到实验结束41周。这些实验表明AaFT和TSFL基因对于LDs下pep1突变体的开花是必需的。
然后在LDs和SDs下22°C的叶片中测量了AaFT和TSFL基因的mRNA丰度。与先前在拟南芥中的研究结果一致，在pep1植株中，AaFT和AaCO mRNA水平在ZT14光周期结束时达到峰值，并在夜间降低。在ZT4观察到TSFL1 mRNA丰度的一个小峰值，而TSFL2 mRNA在ZT4和ZT14都显示峰值。未检测到TSFL3 mRNA。与pep1植株中的水平相比，Aaco pep1突变体叶片中AaFT和TSFL mRNAs的水平降低到不可检测的水平。
一年生拟南芥植株最终在SDs下开花并形成正常的花序，证明光周期非依赖途径可以覆盖其LD需求。我们测试了Aaco pep1和Aaft tsfls pep1突变是否增强了在SDs下观察到的pep1的晚花和受损的花序发育表型。在SDs下，Aaco pep1突变体与pep1突变体开花时间相似，但值得注意的是，在这些条件下，Aaco pep1突变体在PS上形成一些花，并且在ABs上也形成花，而它们在LDs下的PS上则不形成。Aaft tsfls-1 pep1在LDs和SDs下显示出相似的生长模式，并且在SDs下生长时所有节均未能转变为开花。总之，所有AaFT和TSFL基因均失活的植株在LDs下未能形成I1分枝或花，强调了它们在花诱导和花序发育中的重要作用，而缺乏AaCO的植株仅在PS上未能开花。此外，在SDs下，Aaft Aatsfls pep1突变体不形成花，强调了AaFT和TSFL基因在非诱导条件下花序发育中的重要性。
为了解决每个FT/TSFL基因的个体贡献，在pep1背景中产生了AaFT、TSFL1、TSFL2和TSFL3的所有双突变和三重突变，并与先前描述的高阶突变体一起进行表型分析。对每种基因型的开花时间、PS上的单生花形成、I1分枝和AB（V1）开花进行评分。在LDs下，所有双突变体开花都显著晚于pep1。pep1突变体形成约13个V1节，随后约3个I1分枝，然后10-20朵单生花（I2）。Aaft-1 pep1和Aaft-2 pep1突变体最终形成约30个远端部分营养的V1节。随后形成20-30个额外的近端节，产生类似于在SDs下pep1中观察到的更简单的V1分枝。一些植株然后形成由苞片支撑的花状结构，然后逆转产生叶。Aaft-1 pep1和Aaft-2 pep1突变体从未形成单生花。每个tsfl pep1突变体发育的V1节数显著多于pep1突变体，只有tsfl1 pep1产生I1分枝并最终形成一些含有单生花的节。四个AaFT和TSFL基因的突变等位基因的组合导致更极端的晚花和受损的花序发育表型。几个三重突变组合在PS花序上表现出营养特征，例如苞片的形成和逆转形成叶，表明花序分生组织身份的维持受损。四重突变体不形成单生花，但在产生约30个营养节在V1区后，产生约30个含有一个叶及其腋中休眠芽的节。在pep1背景中含有Aaft和tsfl突变组合的四重突变体在初级SAM上不开花，并持续营养生长直至实验结束（200天）。
Aaco and Aaft tsfls mutants in pep1 background can be induced to flower by prolonged vernalization
许多A. alpina材料表现出强制性的春化要求，具有显性PEP1表达才能开花。值得注意的是，pep1敲除突变体仍然对春化有响应，导致与未春化植株相比开花加速。因此，对Aaft tsfls pep1突变体进行春化以评估这是否会克服它们不开花的能力。在22°C的LDs下生长5周的植株暴露于4°C的SDs下12或24周春化，然后返回22°C的LDs。暴露于12周SD春化后，返回LDs后1周在pep1植株上存在可见的花蕾，而在五重突变体上，花蕾的出现严重延迟，仅在返回LDs后20周发生。此外，突变体仅形成少数畸形花，然后PS通过首先形成苞片支撑的花，然后形成叶而逆转为营养发育。因此，Aaft tsfls pep1五重突变体的开花确实在12周SD春化后发生，但与对照pep1植株相比极度延迟，并且仅产生少数花。与AaFT和TSFL2在12周春化后pep1突变体开花中的作用一致，在pep1和Pajares的幼嫩和成熟叶片中，春化后都检测到这两个基因以及AaCO的表达。
然后将Aaft tsfls pep1突变体置于SDs下更长的24周春化期。经过这种处理后，突变体
