油菜黑胫病病原菌时序共接种的动态竞争机制及其对病害发展的调控作用

《Pest Management Science》：Temporal dynamics of co-inoculation of Leptosphaeria maculans and Leptosphaeria biglobosa determine interspecific competition and disease development on oilseed rape

本文通过体内实验揭示了Leptosphaeria maculans (Lm) 与L. biglobosa (Lb) 共接种时序如何通过资源竞争（如营养抢占）和宿主介导的竞争（如系统抗性SAR）调控互作结局。研究发现Lb在Lm接种后1天内介入可显著抑制Lm生长（病斑面积减少69%，DNA含量降至1.9%），而Lm需3天优势才能反制Lb。该研究为利用病原菌生态互作制定油菜黑胫病（phoma stem canker）绿色防控策略提供了新视角。

　　

1 引言

油菜（Brassica napus）作为全球重要油料作物，常年受到黑胫病（phoma stem canker）的严重威胁。该病害由两种子囊菌Leptosphaeria maculans（Lm）和L. biglobosa（Lb）共同引起，其中Lm导致灰色大型叶斑和茎基溃疡，危害更重；Lb则引发黑色小斑和上部茎秆病变。在欧洲，病害流行始于秋季，病原菌以子囊孢子形式从作物残体释放，侵染叶片后经叶柄向下扩展，最终形成茎部溃疡。

近年研究发现，Lm与Lb常在同一油菜植株上共侵染。二者共存得益于生态位分化：Lm子囊壳在低温（5–10°C）下成熟更快，孢子释放早于Lb。但气候变化导致二者释放期重叠增多，尤其在携带Lm抗性基因的品种中，Lb在茎基溃疡中的检出率上升，可能引发种间竞争。病原菌共侵染时的互作策略包括资源竞争（营养抢占）、宿主介导竞争（激活植物免疫）和干扰竞争（毒素抑制）。例如Lb可通过提前接种诱导系统抗性（SAR），抑制Lm致病性；而Lm产生的毒素sirodesmin PL在体外可抑制Lb生长，但Lb能反制其毒素合成。前期体外实验表明，共接种时序显著影响竞争结局：Lb在Lm接种后3天内介入可部分抑制Lm，但5天后失效。本研究旨在揭示时序调控下两种病原菌在油菜体内的互作机制。

2 材料与方法

实验选用油菜品种Charger（无已知抗性基因），分别接种Lm菌株ME24和Lb菌株WH17。设计十种处理：单独接种Lm或Lb、同时接种（Lm&Lb）、Lm先接种后1/3/5天接Lb（Lm+Lb-1/3/5）、Lb先接种后1/3/5天接Lm（Lb+Lm-1/3/5），以灭菌水为对照。接种后定期测量病斑面积，观察产孢结构（分生孢子器），并通过qPCR定量病原菌DNA占比。同时分析防御基因PR-1（SA通路标记）和WRKY33（抗坏死营养病原相关）的表达动态。

3 结果

3.1 病斑表型与发展动态

病斑表型与时序密切关联：Lm单独接种、Lm+Lb-3/5处理组呈现大面积灰色病斑，类似Lm独侵；而Lb独侵、同时接种及Lb优先接种组均表现为黑色小斑。病斑面积统计显示，Lm+Lb-3（63.6 mm²）和Lm+Lb-5（73.4 mm²）与Lm单独接种（67.1 mm²）无显著差异，但Lm+Lb-1病斑面积（20.6 mm²）显著减小。病斑扩展速率分析进一步证实，Lb优先或同时接种可抑制病斑扩张至Lb独侵水平。

3.2 分生孢子器产生

仅Lm独侵、Lm+Lb-3/5处理组在病斑处产生成熟分生孢子器（密度35–37个/0.1 mm²），而Lb相关处理组均无孢子器形成，表明Lb早期介入可完全抑制Lm繁殖结构发育。

3.3 病原菌DNA定量

qPCR结果显示，Lb优先接种组（Lb+Lm-1/3/5）及Lm+Lb-1组中Lm DNA占比均低于2%，而Lm+Lb-3/5组中Lm DNA占比高达97%以上，与Lm独侵组无差异。证明Lb在接种时序领先（或延迟1天内）时可显著压制Lm菌丝生长。

3.4 宿主防御响应

PR-1基因在Lb独侵和同时接种组中上调最显著，且Lb优先接种组（Lb+Lm-3/5）亦引发持续高表达，说明Lb通过激活SA通路介导系统抗性。WRKY33基因在Lb独侵早期（2 dpi）及Lb优先接种组中表达最强，暗示Lb可能增强坏死营养活性以应对竞争。

4 讨论

本研究揭示Lb可通过“双策略竞争”压制Lm：一是资源竞争（快速占领营养生态位），二是宿主介导竞争（诱导SAR）。当时序优势≥3天时，Lm可反制Lb，可能与其毒素sirodesmin PL或宿主免疫阶段转换有关。实践中，Lb子囊孢子提前释放可降低黑胫病整体危害，例如英国部分地区Lb占比上升与病害减轻相关。但气候变化、杀菌剂敏感性差异（Lb对部分药剂更敏感）等因素可能扰动竞争平衡。未来需构建融合环境因子、孢子释放模型及病原互作的预测系统，为油菜病害绿色防控提供新思路。