《Plant Biotechnology Journal》：Knocking Out Two Polyphenol Oxidase Genes Significantly Improves Recombinant Protein Purification in Nicotiana benthamiana
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本研究通过CRISPR-Cas9技术敲除本氏烟中两个关键多酚氧化酶基因（PPOa和PPOb），成功构建了高效重组蛋白表达平台。该平台显著降低了多酚介导的蛋白聚集现象，使SARS-CoV-2 Spike三聚体（St）和流感血凝素三聚体（HAt）的纯化产量提升40%-70%，为植物分子农业（PMF）提供了革命性的技术突破。
引言：底盘工程推动合成生物学发展
底盘工程在合成生物学领域发挥着关键作用。微生物和哺乳动物细胞底盘的设计优化已成功实现多种生物制品的高效生产，包括阿片类药物、维生素B12、托烷类生物碱、抗体和亚单位疫苗。植物分子农业作为替代方案，近年来在重组亚单位疫苗生产方面取得显著进展，例如完成III期临床试验的流感疫苗、首个人用植物源疫苗Covifenz，以及两个在韩国获批上市的兽用疫苗。
然而，与微生物或动物细胞底盘相比，植物底盘因存在丰富内源蛋白和次级代谢物（如萜类和多酚）而更为复杂。这些成分给重组蛋白纯化带来巨大挑战，纯化成本可占总生产成本80%。前期研究发现，植物源重组蛋白（如流感病毒HA三聚体和SARS-CoV-2 Spike三聚体）在镍离子亲和纯化过程中与植物多酚发生强烈相互作用，导致严重蛋白聚集，严重影响纯化效率和产品质量。
多酚与蛋白的相互作用通过共价（不可逆）和非共价（可逆）机制实现。共价结合通常涉及多酚氧化酶（PPO）在氧存在下将多酚氧化为邻醌，后者与蛋白游离氨基或巯基反应形成不可逆复合物。近期研究在本氏烟中鉴定出6个PPO基因，通过VIGS沉默单个PPO基因可抑制酶促褐变和RBCL交联，验证了该假设的可行性。
结果1：关键PPO基因的鉴定与功能验证
通过基因组注释和转录组测序，研究团队在本氏烟中鉴定出6个候选PPO基因。转录组分析显示4周龄叶片中NbL17g16540（命名为PPOa）表达强烈，而NbL10g18390（PPOb）、NbL06g06640（PPOc）和NbL17g16550（PPOd）虽具有高蛋白序列相似性，但表达水平极低。qRT-PCR分析证实不同叶位PPO基因表达量存在显著差异，PPOb、PPOc和PPOd的Ct值均高于35。
为探究功能，研究人员设计了两段300核苷酸的PPOa片段进行VIGS实验。TRV2::PPOa-1载体与PPOb同源区仅差3个核苷酸，可同时靶向两个基因；而TRV2::PPOa-2载体存在9个分散差异，对PPOb的沉默效果有限。实验发现TRV2::PPOa-1而非TRV2::PPOa-2能显著降低酶促褐变和蛋白聚集，提示PPOa和PPOb共同介导这些效应。
结果2：双突变体的构建与表征
基于VIGS结果，研究团队利用CRISPR-Cas9构建了同时敲除PPOa和PPOb的双突变体（#3和#7系）及多个PPOa单突变体。T3代ppoa;ppob突变体表现出萌发延迟，但第四周后生长与野生型相当，生殖发育无显著差异。Western blot和考马斯亮蓝染色证实双突变体内源PPO蛋白完全缺失，单突变体中表达微弱。相应地，野生型提取物酶促褐变明显，单突变体较轻，双突变体完全消失。
为评估对重组蛋白纯化的影响，研究人员在野生型和ppoa;ppob植株中表达GFP-His蛋白。虽然表达水平相似，但镍离子亲和纯化后的SDS-PAGE分析显示双突变体中蛋白聚集（标记为高分子复合物HMC）显著减少，表明消除PPOa和PPOb可通过减轻多酚介导的聚集提高重组蛋白质量。
结果3：病毒蛋白纯化效率提升
在本氏烟中表达的重组HA三聚体和S三聚体在纯化过程中常形成严重聚集。虽然液氮研磨时添加PVPP可吸附部分内源多酚并改善蛋白质量，但该方法因操作复杂不适合大规模生产。本研究在野生型和#3植株中表达纯化HAt和St，Western blot显示目标蛋白表达水平相当，但野生型中持续检测到HMC聚集。
通过等量叶片组织（1克）的镍离子亲和纯化，定量分析显示#3植株中St产量比野生型提高70%，HAt回收率提高40%。有趣的是，野生型纯化的蛋白在SDS-PAGE上呈现更弥散条带和更高表观分子量，推测由多酚结合引起。
对未结合树脂的蛋白组分和不可洗脱组分的分析发现，野生型源HAt在两者中含量均显著更高，表明重组蛋白与树脂相互作用效率低下或不可逆保留。尺寸排阻色谱分析显示野生型源HAt含有更多HMC。LC-MS鉴定发现野生型HMC中包含581种内源植物蛋白，而#3中仅73种，其中16种为#3特有。肽段强度分析显示野生型HMC含63.4%内源蛋白和36.6%HAt，而#3中HAt占比达96.8%。
结果4：多酚污染机制解析
为验证多酚在聚集形成中的作用，研究人员比较了野生型（HA-WT）和#3（HA-#3）植株中纯化的HAt蛋白。未浸润野生型（NT-WT）和#3（NT-#3）作为对照。蛋白结合后，用1M NaOH处理树脂以剥离结合蛋白或树脂的多酚。布拉德福德检测显示所有NaOH洗脱液均未检测到蛋白，而多酚检测显示HA-WT中多酚含量显著高于HA-#3，与HMC状态一致。
质谱分析检测到多种残留多酚，包括绿原酸、儿茶素、苯甲酸等，表明蛋白-多酚相互作用无选择性。其中绿原酸及其结构异构体结合量最大，与其在烟草多酚中的主导地位一致。残留水平与HMC含量呈正相关，证实植物源重组蛋白在纯化过程中存在多酚结合污染。
讨论：植物底盘工程的优化路径
与微生物或哺乳动物平台不同，本氏烟等植物产生复杂的次级代谢物，特别是多酚，在下游处理过程中干扰蛋白提取。本研究证明这些代谢物被PPOs氧化是驱动纯化过程中蛋白聚集的主要因素。通过基因消除PPO活性，明显减少了蛋白-多酚交联，提高了重组蛋白的完整性和可回收性。
通过转录组分析与VIGS结合，研究人员确定PPOa和PPOb是本氏烟中多酚氧化的主要酶。在此基础上构建的ppoa;ppob双敲除突变体在多代中验证了性能。虽然观察到早期生长延迟，但成熟植株无显著发育缺陷，表明敲除系适用于生产规模应用。
值得注意的是，PPOs通过伤口或感染时产生氧化化合物的生化途径参与植物防御机制。尽管温室条件下未观察到ppoa;ppob敲除系对病虫害敏感性增加，但多酚氧化酶的已知生物学功能提示这些植株在露天环境中可能更脆弱。
与先前研究不同，Western blot分析显示GFP、HAt和St在野生型和#3系背景下表达水平无显著差异。这种差异可能源于实验系统：VIGS对植物生长的高度可变影响可能影响异源蛋白积累。
关键的是，虽然表达水平相当，但突变体系纯化的蛋白表现出更高回收效率和均一性。然而即使在双敲除背景下，考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶上仍可检测到微量HMC。多酚检测试剂盒和质谱也检测到少量多酚。这种残留存在可能归因于两个因素：未氧化多酚可能通过非共价相互作用结合蛋白或镍离子亲和树脂；虽然PPOa和PPOb是主要贡献者，但并非唯一涉及的多酚氧化酶。为进一步减少多酚污染，可优化纯化条件破坏非共价相互作用，或在ppoa;ppob背景上进一步敲除PPOc和PPOd评估多酚污染能否消除。
方法学创新：多维度验证技术体系
研究团队通过多种技术手段验证实验结果：构建含三聚化 motifs 的重组基因，采用农杆菌介导的瞬时转化技术，建立高效的VIGS沉默体系，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建突变体，结合蛋白质印迹、尺寸排阻色谱、液相色谱-质谱联用等技术进行多维度分析。特别建立了多酚剥离检测方法，通过NaOH处理分离结合多酚，结合布拉德福德检测和多酚含量测定，量化污染程度。质谱分析采用高分辨率液质联用平台，建立多酚标准曲线，实现精准定量。这些方法为植物分子农业领域提供了可靠的技术支撑。
