《Journal of Agriculture and Food Research》：Dihydromyricetin, a principal flavonoid derived from Vine tea, ameliorates spermatogenic dysfunction by repairing the tight junctions of the blood-testis barrier
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本研究针对环磷酰胺（CTX）诱导的雄性生精功能障碍，探讨了藤茶主要黄酮类成分二氢杨梅素（DHM）的干预效果及作用机制。研究发现，DHM可改善生殖器官病理损伤，提升精子数量、活力和活率，并通过调控TGF-β3/p38 MAPK信号通路，修复血睾屏障（BTB）关键蛋白表达，从而恢复其完整性，为DHM作为改善男性不育的潜在候选药物提供了实验依据。
男性不育已成为一个日益严峻的全球健康与社会问题。据统计，中国的育龄夫妇不孕不育率已达12.5%至15%，而男性因素在其中占据了重要比重。生精功能障碍是导致男性不育的核心原因之一，而这一过程的顺利进行，高度依赖于一个名为“血睾屏障”（Blood-testis barrier, BTB）的特殊结构。你可以将BTB想象成睾丸内部的一道“安检闸门”和“精密育婴房”的围墙，它由相邻的支持细胞（Sertoli cell）通过紧密连接（Tight junction, TJ）等结构构成，其功能是严格筛选进入生精上皮的物质，为精子发生创造一个稳定、受保护的微环境。然而，这道“围墙”本身也相当脆弱。遗传因素、内分泌紊乱、环境污染物（如某些化疗药物）等均可导致BTB结构和功能受损，紧密连接蛋白表达下降或定位紊乱，使得有害物质得以侵入，最终影响精子生成的数量与质量。因此，寻找能够保护并修复受损BTB的药物，成为治疗男性不育的一个潜在突破口。
天然产物一直是新药研发的宝库。二氢杨梅素（Dihydromyricetin, DHM）是传统饮品藤茶（Vine tea）中的主要黄酮类成分，以其卓越的抗炎和抗氧化活性而备受关注。先前的研究表明，DHM在肝脏、血管等组织中展现出强大的抗氧化损伤能力，并可能在其它疾病中通过抑制转化生长因子-β（Transforming growth factor-β, TGF-β）信号通路发挥保护作用。鉴于TGF-β3/p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 Mitogen-Activated Protein Kinase, p38 MAPK）信号通路是调控BTB动态组装与拆解的核心通路，而氧化应激正是激活此通路、破坏BTB的关键推手。那么，具有强力抗氧化特性的DHM，是否也能像守护其它器官一样，成为睾丸和血睾屏障的“守护神”呢？这项发表在《Journal of Agriculture and Food Research》上的研究，首次系统探究了DHM对环磷酰胺（Cyclophosphamide, CTX）诱导的雄性小鼠生精功能障碍的保护作用，并深入揭示了其通过修复BTB紧密连接发挥功效的分子机制。
为了回答上述科学问题，研究人员综合运用了体内动物模型和体外细胞模型。在体内，他们使用ICR品系雄性小鼠，通过腹腔注射CTX建立生精功能障碍模型，并设置不同剂量（37.5， 75， 150 mg/kg）的DHM进行灌胃干预，以左卡尼汀（Levocarnitine, LC）作为阳性对照。在体外，他们使用小鼠睾丸支持细胞系TM4，以CTX的毒性代谢产物丙烯醛（Acrolein, ACR）诱导细胞损伤，并观察DHM的干预效果。研究采用的关键技术方法包括：通过精子分析仪评估精子参数；通过苏木精-伊红（H&E）染色进行睾丸组织病理学评估和生精周期分期；通过生物素（Biotin）示踪技术结合荧光显微镜观察直观评估BTB完整性；通过蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫荧光（Immunofluorescence）技术检测BTB相关连接蛋白（如Occludin， Claudin-11， N-cadherin， Cx43）以及TGF-β3/p38 MAPK信号通路蛋白的表达与定位；通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力；通过荧光标记的鬼笔环肽（Phalloidin）染色观察细胞骨架F-肌动蛋白（F-actin）的结构。
3.1. DHM改善CTX处理小鼠的睾丸组织病理损伤和精子参数
研究结果显示，CTX处理导致小鼠睾丸和附睾的脏器系数显著下降，精子数量、活力和活率严重受损，睾丸生精小管结构紊乱，生精细胞层数减少。而给予75 mg/kg和150 mg/kg剂量的DHM干预后，上述指标均得到显著改善。其中，高剂量DHM（150 mg/kg）的效果最为明显，精子数量、活力和活率恢复至接近甚至优于阳性药物左卡尼汀组的水平。组织学观察也证实，DHM治疗组的生精小管结构更为完整，生精细胞排列有序，管腔内可见更多成熟精子。这些结果直接表明，DHM能够有效缓解CTX引起的生殖器官损伤和精子发生障碍。
3.2. DHM逆转CTX处理小鼠的BTB完整性损伤
为了探究DHM是否通过保护BTB发挥作用，研究人员进行了深入的机制研究。生物素示踪实验发现，CTX处理导致生物素荧光信号从生精小管基底膜大量渗入管腔，表明BTB完整性被严重破坏；而DHM（150 mg/kg）处理则显著减少了荧光渗漏的长度。分子水平上，Western blot和免疫荧光结果显示，CTX显著下调了BTB关键连接蛋白N-钙黏蛋白（N-cadherin）、闭合蛋白（Occludin）、闭合蛋白-11（Claudin-11）和连接蛋白43（Connexin 43, Cx43）的表达，而DHM干预后，这些蛋白的表达量得以恢复，且Occludin和Claudin-11在支持细胞间的定位更为清晰、连续。这些证据共同表明，DHM能够有效修复CTX损伤的BTB结构完整性。
3.3. DHM降低TGF-β3和p-p38 MAPK的蛋白表达
既然DHM修复了BTB，那么它是否影响了调控BTB的核心信号通路呢？对睾丸组织的Western blot分析给出了答案。CTX处理显著上调了TGF-β3蛋白水平和磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）的水平，而总p38 MAPK蛋白量无显著变化。给予150 mg/kg DHM后，TGF-β3和p-p38 MAPK的过度表达被显著抑制。这表明，DHM的保护作用可能与抑制TGF-β3/p38 MAPK信号通路的过度活化有关。
3.4. DHM抑制ACR诱导的TM4支持细胞损伤
体外实验进一步在细胞层面验证了DHM的保护作用。ACR处理显著降低了TM4支持细胞的活力，并破坏了细胞骨架蛋白F-actin的网状结构，使其变得断裂、紊乱。而DHM与ACR共处理，能以剂量依赖的方式提高细胞活力，并有效地恢复了F-actin骨架的完整性和有序排列。这提示DHM能够直接保护支持细胞免受毒性损伤，维持其细胞骨架的稳定，而细胞骨架正是锚定各种连接蛋白、维持细胞连接结构的基础。
3.5. DHM与S-7701联用降低TM4支持细胞中TGF-β3和p-p38 MAPK的蛋白表达并增加Claudin-11
为了更直接地验证TGF-β3/p38 MAPK通路在DHM保护效应中的作用，研究人员在ACR损伤的TM4细胞模型中，使用了TGF-β3抑制剂S-7701。结果发现，DHM或S-7701单独使用都能部分逆转ACR引起的细胞活力下降、TGF-β3/p-p38 MAPK上调和Claudin-11下调。而将DHM与S-7701联合使用时，产生了协同或叠加效应，能更有效地降低TGF-β3和p-p38 MAPK水平，并进一步提升Claudin-11的表达。这一结果有力地支持了DHM通过调控TGF-β3/p38 MAPK通路来维持BTB紧密连接蛋白稳定的分子机制。
综合以上研究结果，本论文的结论与意义可归纳如下：本研究首次系统阐明，源自藤茶的天然黄酮化合物二氢杨梅素（DHM）能够有效改善环磷酰胺诱导的雄性小鼠生精功能障碍。其保护作用的核心机制在于修复受损的血睾屏障（BTB）。DHM通过抑制被氧化应激激活的TGF-β3/p38 MAPK信号通路，上调并稳定了BTB关键紧密连接蛋白（如Occludin， Claudin-11）和粘附连接蛋白（如N-cadherin）的表达，同时维护了支持细胞骨架的完整性，从而重建了BTB的屏障功能，为精子的正常发生创造了健康的微环境。这项研究不仅为理解DHM的生殖保护作用提供了详实的实验数据，更重要的是，它将一种食源性天然产物与男性生殖健康这一重大临床问题直接联系起来，为开发基于DHM的、用于预防或治疗由化疗药物、环境毒素等因素引起的男性不育的潜在功能性食品或药物候选物，奠定了重要的临床前研究基础，展示了从传统植物资源中发掘现代医学解决方案的巨大潜力。
