《Journal of Biological Chemistry》：Decoding the Regulatory Code: O-GlcNAcylation in Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT)
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本综述系统阐释了O-连接N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰通过调控关键蛋白（如β-连环蛋白、E-钙黏蛋白、Snail1）的稳定性、亚细胞定位及功能，在上皮-间质转化（EMT）中扮演“代谢传感器”的核心角色。文章深入探讨了O-GlcNAc与磷酸化的交互作用、EMT对O-GlcNAc水平的反向调控，以及该修饰在肿瘤转移、纤维化等病理过程中的机制，为靶向O-GlcNAc环路治疗EMT相关疾病提供了新视角。
引言
O-连接N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰是一种发生在大多数真核蛋白丝氨酸或苏氨酸残基上的单糖修饰。这种动态可逆的翻译后修饰（PTM）仅由两种酶调控：O-GlcNAc转移酶（OGT）负责添加，O-GlcNAc水解酶（OGA）负责去除。这种独特的调控模式使其能够极其灵敏地响应营养和应激信号。葡萄糖进入细胞后，约有5%会流入己糖胺生物合成途径（HBP），该途径受关键酶如谷氨酰胺果糖-6-磷酸氨基转移酶1（GFAT1）和磷酸葡糖胺变位酶3（PGM3）调控，最终生成尿苷二磷酸N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）。UDP-GlcNAc作为糖基化供体底物，在OGT和OGA的催化下参与细胞内O-GlcNAc修饰过程。
O-GlcNAcylation处于EMT的核心位置，它感知营养和应激信号，指导实现表型可塑性的转录和信号程序，从而奠定了其在纤维化和肿瘤转移中的基本作用。EMT是一个重要的生物学事件，它赋予上皮细胞间质特征，其特征是上皮关键粘附分子E-钙黏蛋白（E-cadherin）的抑制，以及促进运动的间质钙黏蛋白N-钙黏蛋白（N-cadherin）或间质中间丝蛋白波形蛋白（Vimentin）的过表达。
O-GlcNAc修饰与EMT的交互作用
O-GlcNAc修饰全局影响EMT
EMT是一个受到严格调控的转化过程，细胞经历代谢重编程以重新分配能源，包括葡萄糖。O-GlcNAc修饰作为一个重要的化学开关，使细胞能够检测并响应食物可用性和外部信号的波动。O-GlcNAc水平的变化显著影响EMT。作为HBP的关键代谢物，UDP-GlcNAc是O-GlcNAc修饰的底物，它直接调节EMT相关转录因子和信号分子的功能，并促进EMT过程所必需的代谢重编程。
通过药理学方法调节O-GlcNAc水平可以有力地调控EMT过程。例如，OGT抑制剂OSMI-1通过下调SMAD家族成员4（SMAD4）的表达来抑制香烟烟雾诱导的EMT。在子宫内膜癌细胞中，OGA抑制剂Thiamet-G处理引起的高O-GlcNAc修饰增强了EMT蛋白表达和细胞骨架重组。有趣的是，O-GlcNAc稳态的任何波动都会导致EMT的显著变化，这表明维持O-GlcNAc稳态对EMT的精确调控至关重要。
EMT核心分子经历O-GlcNAc修饰
EMT的核心调控分子，如β-连环蛋白（β-catenin）、E-钙黏蛋白和Snail1，是O-GlcNAc修饰的关键靶点，这种修饰深刻影响它们的稳定性、功能和亚细胞定位，从而驱动EMT进程。
β-连环蛋白（β-catenin）
β-连环蛋白是一种双功能蛋白，在Wnt信号传导和细胞粘附中处于关键位置。2014年，研究人员在β-连环蛋白上发现了O-GlcNAc修饰。β-连环蛋白T41位的O-GlcNAc修饰通过直接与磷酸化竞争，抑制了蛋白酶体降解介导的β-连环蛋白降解，从而稳定了β-连环蛋白。此外，β-连环蛋白Ser23位的O-GlcNAc修饰对于维持粘膜完整性、增强其与α-连环蛋白（α-catenin）的结合以及支持其在质膜上的定位至关重要。值得注意的是，β-连环蛋白的O-GlcNAc修饰限制了其核转位，从而削弱其与T细胞因子（TCF）/淋巴样增强因子（LEF）的相互作用，导致Wnt靶基因的转录激活减少。因此，O-GlcNAc修饰作为控制β-连环蛋白稳定性和粘附功能的主要调控因子，使其成为EMT过程中信号传导和细胞粘附的关键整合因子。
E-钙黏蛋白（E-cadherin）
作为经典钙黏蛋白超家族的关键组成部分，E-钙黏蛋白是上皮组织中的主要细胞粘附分子。E-钙黏蛋白的O-GlcNAc修饰发生在其胞质结构域，破坏了E-钙黏蛋白向细胞膜表面的运输，最终导致细胞间粘附能力受损。具体而言，核心EMT转录因子（如SNAIL、TWIST和ZEB1）直接在转录水平抑制E-钙黏蛋白，而O-GlcNAc修饰则在翻译后水平调节其活性。O-GlcNAc修饰通过两种互补机制损害E-钙黏蛋白功能：一是破坏其向前运输，将新合成的E-钙黏蛋白隔离在无功能的细胞内池中，减少其表面定位；二是直接破坏E-钙黏蛋白与p120-连环蛋白（p120-catenin）的结合， destabilizing the cadherin-catenin complex。这种双重损害驱动了粘附连接的分解并促进EMT进展。
Snail1
Snail1作为一个主要的转录抑制因子，与E-钙黏蛋白启动子中的E-box元件结合，从而抑制其转录，同时促进间质标志物的表达。通过协调这种遗传重编程，它驱动EMT，促进细胞运动和转移扩散。研究表明，Snail1是OGT的关键底物。具体而言，Snail1的Ser112位点存在O-GlcNAc修饰。这种修饰通过与相同或相邻残基上的磷酸化竞争来稳定Snail1，从而防止其被靶向蛋白酶体降解。更重要的是，葡萄糖含量与O-GlcNAc水平紧密相关，升高的葡萄糖水平促进了Snail1的O-GlcNAc修饰。因此，在慢性高血糖状态下，剖析纤维化受累各类组织中Snail1的O-GlcNAc状态具有重大意义。
其他分子
除了上述核心分子，EMT的进展还受到其他分子O-GlcNAc修饰的调控。波形蛋白（Vimentin）的O-GlcNAc修饰是维持中间丝形态和细胞迁移能力所必需的。SMAD4的Thr63位O-GlcNAc修饰通过阻断GSK-3β介导的蛋白酶体降解来稳定SMAD4。在高糖条件下，ZEB1的Ser555位点发生O-GlcNAc修饰，增强其稳定性和核转位，诱导脂肪生成相关基因的转录活性，并最终导致间质胰腺癌细胞中脂质过氧化依赖性铁死亡。
EMT非核心分子经历O-GlcNAc修饰
除了经典的EMT分子，许多传统上不归类为“EMT核心调控因子”的分子也可以通过O-GlcNAc修饰间接或协同促进EMT进程。这些非核心分子广泛存在于代谢调控、细胞骨架动力学、信号转导网络和微环境感知等关键通路中。
例如，驱动蛋白样蛋白KIF1A在神经内分泌前列腺癌（NEPC）中高表达，其过表达促进了OGT的核积累和核内β-连环蛋白的O-GlcNAc修饰，这对侵袭性肿瘤生长至关重要。另一方面，O-GlcNAc修饰可以直接发生在非核心EMT分子上。例如，赖氨酸乙酰转移酶5（KAT5）的O-GlcNAc修饰（Ser119位点）可抑制其降解；稳定的KAT5随后可诱导EMT相关基因（如TWIST1）的表达，同时减少E-钙黏蛋白的表达并增强N-钙黏蛋白的表达。MORC家族CW型锌指蛋白2（MORC2）在Thr556位点被O-GlcNAc修饰，这种修饰是SNAIL转录激活所必需的。
这些例子表明，O-GlcNAc可以通过动态调节非核心分子的O-GlcNAc修饰，根据细胞的代谢状态微调EMT过程。
EMT反向影响O-GlcNAc修饰
尽管越来越多的证据阐明了O-GlcNAc修饰通过离散通路调控EMT，但连接这些过程的整合调控网络仍未得到充分表征。近年来，有报道称在EMT过程中O-GlcNAc修饰水平也发生变化。研究表明，EMT通过两个核心机制调控蛋白质O-GlcNAc修饰。
第一个核心机制是己糖胺生物合成途径（HBP）的激活。例如，在A549细胞发生EMT期间，肺癌细胞增强了葡萄糖吸收并将其引导至HBP通路。HBP的激活随后导致异常细胞O-GlcNAc水平的升高。这种代谢转变是由HBP限速酶GFAT1的蛋白质表达和酶活性的相应增加所驱动的。第二个核心机制是OGT和OGA的转录调控。例如，EMT关键转录因子TWIST1的稳定性在很大程度上得益于O-GlcNAc修饰，而TWIST1随后调控OGT的表达，这表明EMT转录因子TWIST1和OGT之间存在潜在的反馈回路。
总之，EMT对O-GlcNAc修饰的调控是精确和多层次的：EMT过程中的变化导致代谢重编程，例如葡萄糖通量增加，为O-GlcNAc修饰提供了底物支持；EMT相关信号通路（如TGF-β和PI3K/Akt）在激活状态下可能调控OGT/OGA的活性和表达；EMT转录因子（如SNAIL和TWIST）可能结合到OGT/OGA的启动子区域，潜在地调控其转录水平；EMT通常伴随着应激反应，如内质网应激和氧化应激，这些应激反应可通过未折叠蛋白反应（UPR）等途径调控O-GlcNAc水平。
O-GlcNAc修饰调控EMT进程的机制
O-GlcNAc修饰与磷酸化协同调控EMT可塑性
O-GlcNAc修饰是另一种关键的可逆PTM，其主要修饰丝氨酸和苏氨酸残基，这与磷酸化相似。O-GlcNAc修饰与磷酸化之间存在复杂的交互作用。
例如，葡萄糖介导的酪蛋白激酶II（CK2）在Ser347位的O-GlcNAc修饰，通过调节COP9信号体2（CSN2）在Ser21/Ser24位的磷酸化，来调控CSN2-Cullin-RING连接酶4（CRL4）复合物的组装和解离。对于EMT转录因子Snail，其Ser112位的O-GlcNAc修饰通过阻断磷酸降解介导的蛋白水解来稳定Snail。与Snail不同，β-连环蛋白最经典的研究是其T41位点同时是O-GlcNAc修饰和磷酸化的靶点。由于发生在相同位点，T41位的O-GlcNAc修饰和磷酸化相互竞争。
蛋白质结构域内的多个可修饰位点使得O-GlcNAc修饰和磷酸化之间能够进行复杂的交互对话，通过动态功能重编程来协调EMT。这种调控通过两种相互关联的机制运作：共享位点竞争，即两种修饰靶向单个蛋白质上相同或相邻的残基，通过空间邻近性实现协同或拮抗相互作用；跨蛋白质协调，即不同蛋白质上的修饰共同协调EMT进程。
O-GlcNAc修饰调节分子亚细胞定位以改变EMT进程
EMT过程中关键分子亚细胞定位的改变是驱动该过程的核心机制。O-GlcNAc修饰通过时空控制核心调控因子的定位来协调EMT进程。
例如，E-钙黏蛋白被O-GlcNAc修饰后，其向细胞膜表面的运输被破坏，使其滞留于细胞内，从而削弱了上皮细胞的粘附功能。另一方面，非核心EMT分子也可以间接调节EMT分子的O-GlcNAc修饰水平来促进EMT过程。以KIF1A为例，KIF1A的过表达可以稳定OGT并促进其核积累，从而使得核内β-连环蛋白发生O-GlcNAc修饰，这对侵袭性肿瘤生长至关重要。此外，丝切蛋白（Cofilin）是一种关键的肌动蛋白切割蛋白，其主要通过解聚和切断现有的肌动蛋白丝来驱动细胞运动。Cofilin的Ser108位O-GlcNAc修饰对于其在三维（3D）细胞侵袭过程中准确定位于乳腺癌细胞前端至关重要。这种位点特异性修饰将肌动蛋白重塑蛋白导向侵袭前沿，而可逆的定位转换允许表型可塑性。
O-GlcNAc修饰调节蛋白质稳定性以驱动EMT进程
O-GlcNAc修饰的一个重要功能是通过调节分子伴侣相互作用和抑制降解途径来维持蛋白质稳定性。
EMT相关蛋白的O-GlcNAc修饰已被证明可通过抑制磷酸化来调节蛋白质稳定性。例如，Ser112位的O-GlcNAc修饰通过抵消磷酸化介导的降解来稳定Snail1，从而增强其抑制活性，导致E-钙黏蛋白转录抑制。在高血糖条件下，增强的O-GlcNAc修饰强化了这一调控轴，促进Snail1介导的E-钙黏蛋白沉默并引发EMT。
一些研究表明，促进癌细胞EMT进程的非经典EMT蛋白的稳定性也依赖于O-GlcNAc修饰。例如，检查点激酶2（CHK2）在肝细胞癌（HCC）的肿瘤发生中起关键作用。研究发现，在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）缺失的情况下，CHK2蛋白Thr378位的O-GlcNAc水平显著增加，从而抑制其泛素化以保护其免于降解。
最后，O-GlcNAc修饰酶的稳定性对于精确协调O-GlcNAc动态变化至关重要，从而在塑造EMT过程中发挥关键作用。例如，E3泛素连接酶UBR5通过控制OGA的稳定性，间接影响EMT过程。UBR5在吉西他滨耐药的胰腺癌细胞中显著上调，并通过促进O-GlcNAc修饰介导的EMT来介导这种耐药性。进一步研究证实UBR5是OGA的E3泛素连接酶，通过结合OGA，UBR5介导OGA稳定性降低，进而促进O-GlcNAc水平升高和EMT激活。
结论与展望
O-GlcNAc修饰作为一种将代谢状态与细胞表型转变联系起来的关键修饰，在阐明EMT复杂性方面具有巨大潜力。作为一种动态的翻译器，将营养流转化为转移能力，这种PTM揭示了细胞可塑性的先前未被认识的维度——揭示了代谢失调如何在恶性进展过程中许可转录重编程和空间重新配置。
破译其对EMT主开关的调控，不仅解开了转移过程中的病理生理学悖论，而且为一种变革性的治疗方法铺平了道路：精确靶向O-GlcNAc电路提供了前所未有的潜力，通过同时拦截代谢脆弱性、表观遗传失调和表型可塑性来破坏自我强化的转移循环。
未来的研究重点包括：破译位点特异性功能影响、提高检测的时间分辨率、开发组织选择性的OGT/OGA调节剂，以及将多组学与功能验证相结合，以释放精准医学的潜力。
