《Biotechnology Progress》：Evaluation of gene editing in CHO cells using the Cas-CLOVER system
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本研究系统评估了新型可编程核酸酶Cas-CLOVER在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的基因编辑效能。研究人员成功利用该系统在30个独特的宿主细胞系中精准敲除谷氨酰胺合成酶（GS）基因，高效获得上百个敲除克隆，并证实了其功能丧失（谷氨酰胺营养缺陷型）。更重要的是，利用该平台构建的单克隆抗体表达细胞池，其产量相较野生型宿主提升了最高14.5倍，为生物制药领域提供了高效的细胞系开发新策略。
引言
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是生产治疗性蛋白的主要哺乳动物表达系统。然而，开发高产、稳定的细胞系通常需要筛选大量克隆，过程耗时且资源密集。基因编辑技术，特别是CRISPR-Cas9系统，极大地简化了哺乳动物细胞系的工程化改造。尽管CRISPR-Cas9在靶点设计上具有简便性，但其早期的脱靶效应问题促使了高保真度变体（如Cas9 nickases、Cas9-HiFi）以及杂交核酸酶系统（如FokI-dCas9和Cas-CLOVER）的出现。Cas-CLOVER结合了CRISPR的靶向精准性和二聚体核酸酶的特异性，在HEK-293细胞和T细胞中已显示出高编辑效率和低脱靶效应。然而，其在CHO细胞中的应用尚未得到深入研究。
材料与方法
本研究采用来自30个无血清悬浮适应的CHO-K1宿主细胞系。通过Cas-CLOVERTM二聚体核酸酶系统（mRNA）和一对靶向GS基因第5外显子的单向导RNA（sgRNA）对细胞进行三次转染，诱导双链断裂。随后通过单细胞分选获得克隆。初步筛选通过96孔板谷氨酰胺营养缺陷型（谷氨酰胺依赖）生长实验进行，即通过测定克隆在含有和不含谷氨酰胺的培养基中生长4天的汇合度变化，筛选出潜在GS敲除（GSKO）克隆。接着，对筛选出的克隆采用三种正交方法进行验证：低分辨率下一代测序（NGS，G-screen）进行高通量基因分型；毛细管电泳片段分析（FA-CE）确定插入/缺失（indel）大小和基因型；高分辨率NGS（G-AmpSM）进行最终确认。此外，对编辑后的克隆在超过60代的培养过程中进行基因组稳定性评估。最后，在随机选定的GSKO克隆和野生型（GSwt）亲本宿主中构建单克隆抗体稳定表达池，比较其在强弱SV40启动子（wtSV40 vs attSV40）驱动GS表达条件下的选择时间和抗体滴度。
结果
GSKO克隆的生成与Cas-CLOVER效率评估
研究人员设计了11对靶向GS基因第5外显子的gRNA对，其中gRNA对11（包含一个27 bp的间隔区）被选中用于后续研究，因其靶向GS酶活性关键氨基酸谷氨酸203（E203）所在区域，可导致潜在移码突变。在30个CHO-K1细胞系中，经Cas-CLOVER编辑后，indel频率在21%到46%之间。通过谷氨酰胺营养缺陷型初筛，从2065个生长正常的克隆中鉴定出751个潜在GSKO克隆，从中随机选取了547个进行进一步评估。
Cas-CLOVER生成的GSKO克隆评估
对547个潜在克隆的低分辨率NGS分析显示，432个克隆检测到序列变异。对其中260个变异频率较高（>10%）的克隆进行深入分析发现，Cas-CLOVER诱导的变异中，78%为缺失，1.4%为插入，12.5%为复杂indel（缺失后插入或反之），8.1%为单核苷酸置换。约94.2%的克隆检测到1-2个变异，表明大部分为二倍体细胞（纯合或杂合缺失）。indel大小分布广泛，从-128 bp到+13 bp，最常见的缺失是-12 bp和-26 bp。重要的是，92.7%的indel起始位点位于包含两个sgRNA及其各自PAM位点的73 bp“indel范围”内，表明切割高度集中。对100个候选克隆的毛细管电泳片段分析确定了四种主要基因型：野生型、杂合野生型、纯合缺失和杂合双缺失。对其中48个克隆进行高分辨率NGS验证，结果与片段分析高度一致（97%的indel大小误差在1 bp内）。所有48个克隆在无谷氨酰胺培养基中均表现出谷氨酰胺营养缺陷型表型（细胞活力下降），包括两个被鉴定为杂合野生型的克隆，这提示单拷贝GS基因失活也可能导致该表型。对其中6个克隆进行长达9天的培养验证，结果也证实了其在有无谷氨酰胺条件下的生长差异。
GSKO克隆在多代培养中的稳定性
对三个克隆及其一个亚克隆进行超过60代（约63天）的跟踪分析，通过毛细管电泳片段分析发现，各等位基因上的indel大小在整个培养期间保持稳定，表明Cas-CLOVER编辑产生的遗传改变在CHO细胞中能够稳定遗传。
GSKO平台的产量提升
研究比较了在6个内部来源的GSwt克隆宿主及其对应的GSKO后代中构建的单克隆抗体表达池的产量。当使用野生型SV40启动子（wtSV40）驱动GS表达并在50 μM MSX（甲硫氨酸亚砜亚胺）压力下筛选时，GSKO池的完成筛选时间与GSwt池相似，产量提升有限，甚至有一个GSKO池产量低于检测限。这可能是由于随机整合导致多个GS表达盒拷贝整合，抵消了内源GS敲除带来的选择压力优势。当使用弱化的SV40启动子（attSV40）驱动GS表达并在10 μM MSX压力下筛选时，GSKO池的筛选时间延长，筛选更严格。此时，GSKO池相较于其GSwt亲本的抗体滴度提升了0到14.5倍，显示出显著的产量提升潜力，尽管这种提升效果存在宿主特异性。
讨论
本研究展示了利用Cas-CLOVER在CHO细胞中快速、高效生成GSKO细胞系的能力，整个流程可在约6周内完成。Cas-CLOVER诱导的indel通常比传统CRISPR-Cas9产生的更大，这可能与其产生非平末端的双链断裂有关，有利于非同源末端连接修复途径，从而产生更大的缺失。这些大缺失可能有助于在杂合状态下实现功能敲除，即使indel未导致移码突变，也可能通过删除关键功能氨基酸残基而破坏酶活性。研究也观察到不同CHO-K1宿主细胞系在GS敲除后生产力提升程度存在显著差异（0-14.5倍），这提示宿主细胞的遗传背景和适应史是影响最终表达表型的关键因素。未来研究可通过多组学分析高性能GSKO克隆，结合Cas-CLOVER等先进工具对宿主基因组进行进一步工程化改造，以阐明和优化决定CHO细胞高效表达系统的关键分子因素。虽然本研究未进行全基因组范围的脱靶效应分析，但现有数据表明Cas-CLOVER在CHO细胞的GS位点编辑具有高度的靶向性和遗传稳定性。
