两性离子脂质纳米颗粒通过增强内涵体逃逸效率实现高效mRNA递送

《Journal of Controlled Release》：Lipid nanoparticles containing zwitterionic lipids versatilely enhance the efficiency of mRNA delivery

本研究针对传统LNP在内涵体逃逸效率低下的瓶颈问题，开发了新型两性离子三油酰基-Tris（zTOT）脂质库。通过将辅助脂质DSPC替换为zTOT代表分子TOT-15，使LNP的基因表达效率提升5倍，并实现近100%的基因敲除效率。该技术通过诱导非层状相变促进膜融合，将内涵体逃逸效率提升至9.6%以上，为核酸药物递送系统提供了创新解决方案。

在生物医药领域，mRNA技术如同一位精准的"信使"，能够指导细胞生产治疗性蛋白，为遗传疾病、癌症和传染病带来革命性的治疗方案。然而，如何将脆弱的mRNA分子安全、高效地递送到目标细胞内部，始终是科学界面临的重大挑战。脂质纳米颗粒（LNP）作为目前最先进的递送载体，虽然在COVID-19疫苗中取得了巨大成功，但其核心瓶颈——内涵体逃逸效率低下——始终未能突破。研究表明，即使是最先进的LNP制剂，其内涵体逃逸效率也仅为个位数，这意味着超过90%的mRNA最终会在细胞内被降解，无法发挥治疗作用。

这一问题的根源在于细胞内的防御机制。当LNP被细胞吞噬后，会被困在名为"内涵体"的膜结构小泡中。传统LNP主要依赖离子化脂质在酸性环境下带正电，与内涵体膜中带负电的磷脂相互作用引发膜融合。但生物膜中大量存在的电中性磷脂酰胆碱（PC）会稳定脂质双层结构，抑制相变过程，成为内涵体逃逸的"守门人"。

针对这一挑战，北海道大学的研究团队在《Journal of Controlled Release》上发表了一项突破性研究。他们独辟蹊径，设计了一类新型的两性离子三油酰基-Tris（zTOT）脂质库，通过分子创新巧妙地"化敌为友"，让原本阻碍膜融合的PC成分转变为促进相变的关键角色。

研究人员采用微流控混合技术制备mRNA-LNP，通过体内外实验系统评估其递送效率。利用TNS法测定LNP表观pK_a值，采用³¹P NMR分析脂质多态性，通过溶血实验验证膜破坏能力。体内实验使用BALB/c小鼠模型，通过荧光素酶报告基因、GFP表达和CRISPR/Cas9介导的TTR基因敲除评估功能递送效率，并采用qRT-PCR定量肝脏mRNA动力学以计算内涵体逃逸效率。

3.1. zTOT库的设计与表征

研究团队设计了7种不同头基结构的zTOT分子，其中TOT-15通过谷氨酸与Tris缩合形成两性离子头基，搭配三个油酰基支架。与传统DSPC-LNP相比，TOT-15-LNP在保持相似理化性质的同时，表观pK_a值提高0.2单位，为6.3。

3.2. zTOT-LNP可多功能增强mRNA表达

在肝脏基因表达实验中，所有zTOT-LNP均优于DSPC-LNP，TOT-15-LNP的荧光素酶活性达到后者的5倍。这种增强效应在不同离子化脂质（包括MC3、ALC-0315等临床常用脂质）组成的LNP中普遍存在，且在肌肉和脑室内给药时同样有效。值得注意的是，TOT-15-LNP在冻融循环和4℃储存条件下保持稳定，具有临床应用潜力。

3.3. 在高效基因组编辑中的应用

在CRISPR/Cas9系统中，TOT-15-LNP在0.3 mg/kg剂量下可实现95%的TTR蛋白敲除，而DSPC-LNP仅为77%。在1.0 mg/kg剂量下，敲除效率超过98%，且效果可持续至少1个月。毒性评估显示，TOT-15-LNP在血液生化参数和组织病理学方面均未引起显著异常。

3.4. TOT-15-LNP增强基因表达的机制

研究表明，基因表达增强并非源于体内分布差异，而是细胞内过程改善所致。³¹P NMR显示TOT-15与POPC混合后可诱导非层状结构形成。溶血实验证实，在pH 6.0条件下（模拟早期内涵体环境），TOT-15-LNP可有效破坏红细胞膜，而在中性条件下无此效应。

3.5. TOT-15-LNP内涵体逃逸效率的药代动力学计算

通过定量分析肝脏mRNA动力学，研究发现TOT-15-LNP的内涵体逃逸效率超过9.6%，显著高于文献报道的多数递送系统（通常为1-2%）。在给药6小时后，TOT-15-LNP组肝脏mRNA残留量是DSPC-LNP的1.8倍，证实了其高效的胞质递送能力。

这项研究通过巧妙的分子设计，使zTOT能够与内涵体膜中的PC形成离子对，将PC的圆柱形结构转变为锥形结构，从而促进膜融合。TOT-15的三大结构特征——两性离子头基、灵活的电荷取向和庞大的疏水区——共同赋予了其破坏生物膜稳定的独特能力。

尤其值得关注的是，TOT-15-LNP展现出的"智能"响应特性：在血液中性环境下保持惰性，避免与血细胞发生非特异性相互作用；而在内涵体酸性环境中被激活，有效促进膜融合。这种环境响应性设计为降低核酸药物毒性提供了新思路。

研究的另一重要创新是建立了体内内涵体逃逸效率的定量计算方法，通过分析mRNA在肝脏中的双相降解动力学，为评估递送系统性能提供了新标准。计算得到的超过9.6%的逃逸效率，使TOT-15-LNP跻身目前最高效的核酸递送系统之列。

尽管在SM-102和CL15H6等少数高pK_a值离子化脂质中，TOT-15的增强效果不明显，这可能与不同离子化脂质的三维结构和脂质-脂质相互作用差异有关。但总体而言，用TOT-15替代传统辅助脂质DSPC的策略，为提升现有LNP制剂的递送效率提供了一条通用、可行且易于产业化的路径。

这项研究不仅开发了一类新型高效递送材料，更深化了我们对LNP与生物膜相互作用机制的理解。随着个性化医疗和基因治疗时代的到来，这种能够显著提升核酸药物递送效率的技术平台，有望加速mRNA疗法在更广泛疾病领域的临床应用，为无数患者带来新的治疗希望。