《Journal of Hazardous Materials》：Impact of sulfonamides on microbial community and antibiotic resistome profiles in anaerobic digestion of swine wastewater
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抗生素在猪废水厌氧消化过程中对微生物群落和抗性基因库的影响研究，采用高通量测序和混合组装技术，发现磺胺类抗生素显著富集sul2和sul3抗性基因，并促进可移动遗传元件的传播，其中Enterococcus属成为优势菌群，Filifactoraceae家族菌株呈现多重耐药风险。
周琴毛|梁和斌|黄金|乌利·克吕姆珀|方佩菊|余泽辉|王玉阳|托马斯·U·贝伦登克|林琳|李晓燕|李冰
生态环境部微生物应用与风险控制重点实验室，清华大学深圳国际研究生院，中国深圳518055
摘要
猪废水中的残留抗生素会促进抗生素耐药组的增殖，对环境和人类健康构成重大威胁。尽管厌氧消化（AD）被广泛用于处理猪废水，但抗生素在厌氧消化过程中对微生物群落和耐药组的影响仍不清楚。本研究采用扩增子和宏基因组测序技术，结合长读长和短读长混合组装方法，全面研究了磺胺类药物对厌氧消化过程中微生物组和耐药组的影响。能够利用外源性叶酸的肠球菌属被确定为在磺胺类药物压力下的优势菌属。共鉴定出24种抗生素抗性基因（ARG）类型和440个亚型。磺胺类药物压力选择性地富集了磺胺类抗性基因，而对其他类别抗生素的抗性基因没有明显的共选择效应。短期暴露显著富集了（3.8倍）和（4.0倍）基因，而长期暴露则富集了（1.6倍）基因。磺胺类药物特别促进了可移动和不可移动质粒上磺胺类抗性基因的增殖。多个类别的可移动遗传元件与抗性基因在同一 contig 上的共同存在被认为在推动抗性基因传播中起着关键作用。虽然肠球菌_I属的菌株成为厌氧消化系统中的优势耐药菌株，但属于 Filifactoraceae 科的菌株被鉴定出具有多重耐药风险。这项工作为抗生素在猪废水厌氧消化处理过程中对微生物群落和抗生素耐药组组成及动态的影响提供了新的见解。
引言
畜牧业，尤其是养猪业，是全球食品生产体系的重要组成部分，对粮食安全和农业经济有着重要影响。全球每年猪肉消费量超过1.28亿吨，其中中国占比达到60%[12]。作为世界上最大的猪肉生产国，中国每年平均生产4.49亿头猪[21]。这种大规模的生产导致了大量猪废水的排放，仅中国每年就排放超过4.6亿吨[55]。猪废水是由猪粪便和尿液混合产生的废水，富含有机物和营养物质，其特征是化学需氧量（COD）在1,000至30,000 mg/L之间，氨氮（NH3-N）含量为400-2,000 mg/L，总氮（TN）浓度为600-2,400 mg/L，总磷（TP）浓度为50-300 mg/L[17, 55]。如果管理不当，这些特性将带来严重的环境挑战。
在养猪业中广泛使用抗生素来预防猪只的细菌感染和疾病[53]。Acosta等人[1]指出，如果现状不变，到2040年全球畜牧业抗生素消耗量预计将达到约143,481吨，比2019年的基准水平（约110,777吨）增加29.5%。值得注意的是，磺胺类药物（SAs）和四环素是畜牧业中最常用的抗生素[Niavol等人，2024年]。大多数抗生素在养猪业中被过度使用或滥用，这带来了一系列环境风险[23]。由于大多数抗生素不能被动物完全吸收，30%-90%的母体化合物通过尿液和粪便排出，最终进入土壤或自然水系统[62]。先前的研究在环境水体中检测到抗生素浓度从纳克/升到毫克/升不等[2, 65]。与其他抗生素（如四环素）相比，磺胺类药物在环境中相对稳定，因为它们不易发生水解和吸附作用[6, 68]。据报道，越南水产养殖废水中的磺胺甲噁唑（SMX）浓度高达7 mg/L[10]，欧洲猪粪便中的磺胺类药物浓度为20 mg/kg[Larissa等人，2022年]，韩国畜禽废水湿地入口处的磺胺甲噁唑（SMX）浓度为11.58 mg/L，磺胺甲嗪（SMZ）浓度为30.03 mg/L[18]。环境中的残留抗生素可以通过选择、共选择和通过可移动遗传元件（MGEs）进行的水平基因转移（HGT）促进耐药细菌（ARB）和抗生素抗性基因（ARGs）的增殖[36, 70]。作为典型的“同一健康”问题，抗生素耐药组对环境和人类健康构成重大威胁[34]。猪废水由于其高有机物含量、营养物质以及残留抗生素的特性，这些因素推动了抗生素耐药组的增殖，因此存在显著的环境和健康风险，需要立即和有效的管理。
厌氧消化（AD）被广泛认为是处理高浓度有机废水（如猪废水）的首选技术。它同时减少了能源需求，产生了可再生能源（如甲烷和氢气），是一种绿色且低碳的处理方法，具有显著的环境和经济效益[22, 69]。抗生素对厌氧消化过程及其过程中耐药基因传播的影响是环境研究中的一个日益关注的领域。Cai等人[9]报告称，抗生素压力会降低厌氧消化系统中的微生物多样性，从而可能增加耐药细菌和耐药基因的入侵成功率[4]，同时还会改变甲烷生成菌等功能性微生物的分布。Zhang等人[63]研究了三个全规模厌氧消化处理厂中猪废水中的抗生素耐药组变化，表明抗生素耐药组的变化受到细菌群落演替和水平基因转移的共同影响。此外，在抗生素暴露下，耐药细菌和耐药基因的丰度会增加，对环境构成潜在风险[50, 66]。然而，个别抗生素如何影响耐药组（包括耐药基因、可移动遗传元件和耐药细菌）及其在猪废水中的相互关系仍不清楚，尽管明确这些关系对于有针对性地控制抗生素耐药组和生态风险管理至关重要。
在本研究中，建立了实验室规模的厌氧 sequencing 批量生物反应器（ASBRs）来处理含有不同磺胺类抗生素的合成猪废水。采用结合第二代和第三代宏基因组方法的混合组装和分箱工作流程，系统地描述了磺胺类药物在厌氧消化过程中对微生物群落和抗生素耐药组的具体影响，包括耐药基因、代表性的可移动遗传元件（如质粒、复合转座子和整合子）以及耐药细菌。本研究旨在填补当前关于抗生素压力下微生物组和耐药组动态的知识空白，为猪废水厌氧消化处理过程中抗生素的影响提供新的见解。
实验设计及操作
为了获得既无抗生素又具有高产甲烷能力的接种物，从中国广东省佛山市的一家啤酒废水处理厂收集了厌氧产甲烷种子污泥，用于启动实验室规模的ASBRs，其工作体积为500 mL。浓缩种子的物理化学参数和最终ASBRs的参数见表S1。合成猪废水的制备基于先前的研究，详细信息见表S2。最初，使用了100 mL的...
磺胺类药物干扰并改变了微生物群落结构
为了阐明抗生素在猪废水厌氧消化过程中对微生物群落结构的影响，使用ACE指数（图S2a）和Shannon指数（图1a）分析了各组的微生物α多样性。ACE指数与所有组的批次数量呈显著负相关（p < 0.01，SMZ组除外），表明随着厌氧培养的进行，物种丰富度逐渐下降。这表明...
结论
本研究表明，在磺胺类药物压力下，微生物群落结构受到干扰，而微生物则动态适应了这种压力，逐渐简化和分化。肠球菌属（属于Firmicutes门）被确定为优势菌属。所有样本中共鉴定出24种抗生素抗性基因类型和440个亚型。磺胺类药物压力选择性地富集了磺胺类抗性基因，而没有与其他类型的抗生素抗性基因发生明显的共选择效应。
环境影响
已知猪废水中的残留抗生素会促进抗生素耐药组的增殖，对环境和人类健康构成重大威胁。本研究发现，磺胺类药物压力改变了微生物群落结构，肠球菌成为优势菌属。磺胺类药物选择性地富集了磺胺类抗性基因，而没有共选择其他类型的抗生素抗性基因。多种可移动遗传元件推动了耐药基因的水平基因转移。
CRediT作者贡献声明
林琳：监督。
托马斯·U·贝伦登克：撰写 – 审稿与编辑，验证。
李冰：撰写 – 审稿与编辑，验证，监督，方法学，研究，资金获取，概念化。
李晓燕：验证，监督。
方佩菊：验证，方法学。
乌利·克吕姆珀：撰写 – 审稿与编辑，验证。
王玉阳：方法学，数据整理。
余泽辉：可视化，方法学。
黄金：验证，方法学。
梁和斌：可视化，验证。
利益冲突声明
作者声明他们没有可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2022YFE0103200）、国家自然科学基金（项目编号22176107和22476108）、深圳市科技创新局（项目编号SGDX20230821091559021）以及德国联邦教育与研究部（项目编号01DO2200）的资助。
