《Advanced Science》：Mitochondrial CircRNA CircMT-RNR2 Safeguards Antioxidant Defense to Support Fibroblast Functions in Wound Repair
线粒体环状RNA CircMT-RNR2通过稳定PRDX3维持抗氧化防御支持成纤维细胞在伤口修复中的功能
摘要
糖尿病足溃疡（DFUs）是糖尿病的严重并发症，其突出特征是线粒体功能障碍和氧化应激，但具体机制尚未明确。本研究发现线粒体编码的环状RNA（mecciRNA）circMT-RNR2是人体皮肤伤口愈合中线粒体氧化还原稳态的新型调节因子。CircMT-RNR2在DFU患者组织和糖尿病小鼠伤口中表达降低，在真皮成纤维细胞中富集，并定位于线粒体。其缺失通过 destabilizing 线粒体抗氧化蛋白PRDX3，导致氧化应激升高、线粒体损伤和线粒体自噬，从而损害成纤维细胞增殖、迁移、细胞外基质生成和收缩。在小鼠和人体外伤口模型中，敲低circMT-RNR2延缓愈合，而过表达则加速修复并增强抗氧化防御。这些发现表明circMT-RNR2是皮肤愈合的线粒体守护者，也是DFU有潜力的治疗靶点。
1 引言
糖尿病是一种广泛存在的慢性代谢性疾病，其严重并发症之一的糖尿病足溃疡（DFUs）尤为棘手。DFUs以慢性炎症、血管化受损和伤口愈合停滞为特征，通常与活性氧（ROS）水平升高相关，后者加剧组织损伤。尽管医学不断进步，有效的DFU疗法仍然有限，凸显了深入了解其潜在机制的必要性。
线粒体是细胞代谢、ATP产生和氧化还原信号的核心，也是细胞内ROS的主要来源。在生理条件下，线粒体ROS（mtROS）作为信号分子；然而，在线粒体应激或功能障碍期间，mtROS的产生和释放变得失调。连接线粒体功能障碍与mtROS释放的一个关键机制是线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放，这是线粒体内膜上的一种非特异性通道，在钙水平升高和氧化应激时开放。持续的mPTP开放破坏线粒体膜电位，促进过量的mtROS释放到胞质中，从而放大氧化损伤。
线粒体氧化还原平衡对伤口修复至关重要，因为受控的ROS信号促进成纤维细胞增殖、细胞外基质（ECM）合成和组织重塑，而过量的ROS则导致氧化损伤、慢性炎症和愈合受损。在DFUs中，这种平衡被线粒体功能障碍和受损的抗氧化防御（包括过氧化还原蛋白III（PRDX3）的下调）所破坏，这进一步放大了氧化应激并阻碍组织修复。因此，恢复线粒体氧化还原稳态是改善慢性伤口结局的有前景的策略。
环状RNA（circRNAs）是共价闭合的单链RNA，通过调节转录和剪接、稳定mRNA、影响翻译和干扰信号通路，已成为基因表达的关键调节因子。虽然大多数circRNAs来源于核基因组，但最近的研究在动物中发现了由线粒体基因组编码的circRNAs（mecciRNAs）。尽管它们的生物发生和周转尚不清楚，但mecciRNAs越来越被认为是线粒体功能的调节因子。例如，mecciND1和mecciND5作为分子伴侣促进线粒体蛋白导入。MecciRNA SCAR结合ATP5B抑制mPTP开放并减少ROS输出，先前研究表明其影响慢性淋巴细胞白血病和非酒精性脂肪性肝炎等疾病。鉴于线粒体功能障碍在DFUs中的核心作用，我们假设mecciRNAs可能也参与糖尿病伤口发病机制。
本研究鉴定出在DFUs中下调的mecciRNA circMT-RNR2是成纤维细胞功能和伤口修复的关键调节因子。CircMT-RNR2通过与抗氧化蛋白PRDX3相互作用并使其稳定，维持线粒体氧化还原稳态，从而限制ROS诱导的损伤，促进成纤维细胞增殖、细胞外基质沉积和组织收缩。这些发现揭示了mecciRNAs与糖尿病伤口愈合中氧化还原控制之间的新联系，凸显了慢性伤口的一个有前景的治疗靶点。
2 结果
2.1 CircMT-RNR2表达在糖尿病足溃疡中下调
从我们先前对人类皮肤和伤口组织中circRNAs的RNA测序分析中，我们鉴定了一组mecciRNAs。其中，circMT-RNR2，一种来源于线粒体基因MT-RNR2（编码线粒体核糖体16s rRNA的大亚基）的环状RNA，在DFU组织（n = 65）中与正常人类皮肤（n = 35）相比显著下调，这通过qRT-PCR得到证实。在皮肤和DFU样本中，circMT-RNR2在真皮中的表达均高于表皮，与其在真皮成纤维细胞中相对于表皮角质形成细胞的富集一致。绝对qRT-PCR进一步显示每个成纤维细胞中存在1473 ± 75个circMT-RNR2拷贝。基于这些发现，我们后续实验聚焦于人成人真皮成纤维细胞（HDFa）以研究circMT-RNR2的功能作用。
CircMT-RNR2的连接位点通过Sanger测序验证。与其他mecciRNAs一样，我们在连接点侧翼鉴定出重复序列基序，人类中为CCCAAAC，小鼠中为AAAGAAA，可能参与mecciRNA的生物发生。CircMT-RNR2的线粒体起源得到以下观察的支持：用线粒体RNA聚合酶抑制剂IMT1处理HDFa显著降低了circMT-RNR2的丰度。这种降低与线粒体RNA（ND1和16S rRNA）的减少平行，但不影响核转录本C2。CircMT-RNR2的环状结构通过其对RNase R消解的抵抗性得到进一步证实，RNase R降解线性RNA而非环状RNA，这通过qRT-PCR和Northern印迹分析证明。
为了确定circMT-RNR2的亚细胞定位，将HDFa分馏为核、质和线粒体区室。MALAT1（核）、GAPDH（胞质）和ND1（线粒体）的富集证实了分馏的效率，这在线粒体蛋白TFAM和胞质蛋白β-肌动蛋白的Western印迹分析中得到进一步验证。这些分析显示circMT-RNR2主要定位于人真皮成纤维细胞的线粒体。这种线粒体富集通过荧光原位杂交（FISH）得到进一步证实，显示circMT-RNR2与线粒体标记MitoTracker Red共定位。
我们接下来研究了可能调节circMT-RNR2表达的伤口微环境因素。用对伤口修复至关重要的细胞因子和生长因子处理HDFa显示，表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）显著增加了circMT-RNR2水平。相反，高葡萄糖和缺氧条件降低了其表达。总之，这些发现表明DFU中观察到的circMT-RNR2减少可能是由于低EGF/FGF2水平、高血糖和这种慢性伤口类型特有的缺氧共同作用的结果。
2.2 CircMT-RNR2缺失损害伤口愈合关键的成纤维细胞功能
我们接下来检查了circMT-RNR2在成纤维细胞驱动的伤口修复过程（包括增殖、迁移、收缩和ECM产生）中的作用。由于线粒体拥有RNA干扰机制，并且线粒体circRNAs的siRNA介导的敲低已被证明，我们使用靶向其连接位点的siRNA（si-CircMT-RNR2）在HDFa细胞中沉默了circMT-RNR2。qRT-PCR证实了circMT-RNR2的有效线粒体敲低，而不影响线性MT-RNR2表达。
敲低circMT-RNR2损害了多个对伤口修复关键的成纤维细胞功能。Incucyte活细胞成像显示增殖显著减少，这得到增殖标记MKI67表达降低的进一步支持。在划痕实验中，circMT-RNR2缺陷的成纤维细胞与对照相比显示出微小但显著的迁移延迟。此外，circMT-RNR2敲低削弱了TGF-β1诱导的ECM基因（COL1A1, FN1, ELN）以及编码α-SMA（成纤维细胞收缩性的关键驱动因子）的ACTA2的表达。
转录组微阵列分析显示，circMT-RNR2敲低后，有375个基因下调和222个基因上调。KEGG通路富集显示，细胞周期是下调基因中受影响最显著的通路。转录因子（TF）富集分析进一步确定FOXM1是这些基因的顶级上游调节因子，大多数FOXM1靶标属于细胞周期通路。鉴于FOXM1是成纤维细胞迁移、氧化应激反应、炎症和伤口修复的公认调节因子，并在DFU病理中涉及，这些发现表明circMT-RNR2至少部分通过维持FOXM1驱动的转录程序来支持成纤维细胞功能。总之，circMT-RNR2是成纤维细胞增殖、运动、ECM产生和收缩的关键调节因子，从而促进有效的伤口愈合。
2.3 CircMT-RNR2保障线粒体氧化还原稳态
鉴于其线粒体起源和定位，我们将circMT-RNR2敲低后的微阵列数据集与人类MitoCarta3.0数据库进行了比较。16个核编码的线粒体蛋白的转录本下调，而9个上调。值得注意的是，下调基因包括GSR、PRDX2、CISD1、BCL2L13、PPIF、SLC25A40和CYCS，它们都参与氧化应激反应通路。与此一致，基因集富集分析（GSEA）显示下调基因中氧化应激反应通路显著富集。
为了直接评估氧化应激，我们用MitoTracker Green（线粒体）和MitoSOX Red（线粒体超氧化物）共染色HDFa。CircMT-RNR2敲低增加了线粒体ROS水平，表明氧化应激升高。在高糖条件下观察到类似的ROS升高，表明circMT-RNR2缺陷模拟了高糖诱导的应激。Seahorse分析进一步显示，circMT-RNR2敲低增加了氧消耗率（OCR）以及基础和最大呼吸。有趣的是，增强的线粒体呼吸 coupled with 升高的ROS在慢性糖尿病并发症（包括DFU）中有报道，其中它损害成纤维细胞功能和伤口愈合。
鉴于线粒体ROS的显著增加，我们接下来检查了mPTP调节是否受到影响。与用si-Ctrl处理的HDFa相比，circMT-RNR2敲低导致Calcein AM荧光显著降低，表明更大比例的线粒体保持mPTP开放状态。持续的mPTP开放已知通过促进膜电位丧失和促进线粒体ROS释放来加剧线粒体功能障碍，表明增加的mPTP开放有助于circMT-RNR2耗竭后观察到的升高氧化应激。
对circMT-RNR2敲低后375个下调基因的代谢通路分析显示，circMT-RNR2沉默影响了氧化型谷胱甘肽通路，表明氧化应激相关损伤。这与GSR（谷胱甘肽回收所必需）和GLO1（解毒有害糖酵解副产物）的缺失相关。GLO1活性降低促进糖尿病模型中晚期糖基化终末产物（AGE）积累，这是糖尿病并发症的已知驱动因子。另一个关键的抗氧化基因GPX3也下调；作为一种有效的血浆过氧化物酶，GPX3通过还原过氧化氢和脂质氢过氧化物来保护细胞。qRT-PCR证实了circMT-RNR2沉默后GPX3、GSR和其他抗氧化剂（包括NRF2、NQO1、GCLC、SOD1和SOD3）的表达降低。NRF2是抗氧化反应的主调节因子，在氧化应激下易位至核内，诱导如NQO1（醌解毒）、GCLC（谷胱甘肽合成）和SOD1/3（胞质和细胞外空间超氧化物歧化）等酶，共同形成协调的防御网络，维持氧化还原平衡并保护细胞免受氧化损伤。重要的是，对来自健康皮肤（n = 9）和DFU伤口边缘组织（n = 11）的已发表单细胞RNA测序数据的重新分析显示，与非糖尿病皮肤相比，DFU的真皮成纤维细胞中这些抗氧化基因一致下调，强调了circMT-RNR2缺陷的临床相关性。
CircMT-RNR2沉默也上调了参与线粒体自噬的PGAM5和BNIP3L基因。Western印迹证实了NIX（一种线粒体自噬受体）和SIRT3（一种线粒体自噬激活剂）的水平增加，同时TOMM20（一种线粒体完整性标记）减少，表明线粒体自噬增强和线粒体损伤。全局自噬活性分析显示，在氯化铵（NH4Cl）处理后，circMT-RNR2敲低增加了LC3-I和LC3-II的积累，NH4Cl通过中和酸性抑制溶酶体降解并导致自噬体积累。这证明了circMT-RNR2沉默后自噬流升高。
总之，这些数据表明circMT-RNR2不仅通过维持抗氧化防御，而且通过限制ROS敏感的mPTP开放来维持线粒体氧化还原稳态。其缺失促进氧化应激、线粒体功能障碍、mPTP开放和代偿性线粒体自噬，从而模拟糖尿病相关的细胞功能障碍。
2.4 CircMT-RNR2与PRDX3相互作用并使其稳定
为了研究circMT-RNR2的分子机制，我们使用RNA pulldown在HDFa细胞中分析了其蛋白质相互作用组。一个靶向circMT-RNR2连接位点的生物素标记的探针与对照探针相比，将circMT-RNR2富集了超过4000倍，这通过qRT-PCR证实。银染显示circMT-RNR2探针比对照拉下更多蛋白质。无标记质谱鉴定出37种蛋白质与circMT-RNR2探针显著富集。尽管pulldown使用全细胞裂解物，但前11种富集蛋白质中有5种是线粒体蛋白，支持了这种circRNA的线粒体定位和功能。其中，过氧化物还原蛋白3（PRDX3），一种线粒体特异性ROS清除剂，鉴于circMT-RNR2在线粒体氧化还原平衡中的作用，引起了特别关注。RNA-蛋白质相互作用预测（RPISeq）分析预测了强烈的circMT-RNR2-PRDX3相互作用，RF和SVM分类器的得分均高于0.5结合阈值。用PRDX3抗体进行的RNA免疫沉淀（RIP）证实了这种相互作用：与IgG对照相比，circMT-RNR2在PRDX3免疫沉淀物中显著富集。
此外，我们使用Chai-1（AlphaFold3）预测了circMT-RNR2-PRDX3 RNA-蛋白质复合物的3D结构，并使用PyMOL分析了circMT-RNR2内假定的PRDX3结合区域。为了验证这些计算机预测，我们设计了四个反义寡核苷酸（ASOs）靶向预测的PRDX3结合位点，并将其转染到人真皮成纤维细胞中。RIP测定显示，当使用阻断相对于BSJ的核苷酸53-65的ASO1时，PRDX3未能拉下circMT-RNR2，而其他ASOs没有可比效果。这些结果表明该区域对PRDX3结合至关重要。此外，通过组合荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光（IF）分析观察到的circMT-RNR2 RNA和PRDX3蛋白的胞质共定位，进一步支持了circMT-RNR2和PRDX3之间的直接相互作用。
此外，我们发现PRDX3蛋白水平在circMT-RNR2敲低后降低。为了评估circMT-RNR2是调节PRDX3的产生还是降解，用放线菌酮（CHX）处理成纤维细胞以阻断翻译，并结合溶酶体或蛋白酶体抑制剂以防止蛋白质降解。阻断降解而非翻译，恢复了circMT-RNR2耗竭细胞中的PRDX3水平，表明circMT-RNR2稳定PRDX3蛋白。这得到细胞热位移分析（CETSA）的支持，其中circMT-RNR2沉默降低了PRDX3的熔解温度，表明蛋白质稳定性降低。有趣的是，观察到相互调节，因为qRT-PCR显示PRDX3耗竭显著降低了人真皮成纤维细胞中的CircMT-RNR2水平，表明circMT-RNR2-PRDX3相互作用有助于维持两个结合伙伴的丰度。
PRDX3对线粒体功能和氧化应激保护至关重要。其敲低增加线粒体ROS，破坏线粒体功能，并损害癌细胞增殖。在成纤维细胞中，我们显示PRDX3沉默（降低了细胞增殖和MKI67表达（一种增殖标记），降低了ECM基因表达（COL1A1, FN1, ELN），并降低了ACTA2水平。它还降低了抗氧化酶（GPX3, NQO1, GCLC, SOD1, SOD3, GSR）和主抗氧化调节因子NRF2的表达。因此，PRDX3敲低模拟了circMT-RNR2耗竭，损害了成纤维细胞增殖、ECM产生、收缩性和线粒体抗氧化防御。这些结果支持了一个模型，其中circMT-RNR2结合并稳定PRDX3以保持线粒体氧化还原稳态。
2.5 CircMT-RNR2在小鼠体内伤口模型中为伤口愈合所必需
鉴于circMT-RNR2在人类和小鼠之间是保守的，我们检查了其在小鼠伤口愈合模型中的表达。CircMT-RNR2在伤口成纤维细胞中与皮肤成纤维细胞相比上调，并且在真皮中比表皮中更丰富，反映了其在人类皮肤中的分布。在野生型小鼠中，circMT-RNR2水平在伤口愈合过程中逐渐增加，而在db/db小鼠（2型糖尿病模型）中，其表达保持不变，与人类DFU中circMT-RNR2减少一致。
为了测试circMT-RNR2是否为伤口修复所必需，我们在野生型小鼠背部皮肤伤口受伤后立即以及两天后局部应用si-CircMT-RNR2或si-Ctrl，并在六天内监测愈合。Si-CircMT-RNR2处理显著降低了真皮circMT-RNR2表达直至第6天，而不影响体重，表明无全身毒性。宏观上，circMT-RNR2敲低延迟了伤口闭合。第6天伤口的苏木精和伊红（H&E）染色证实了收缩和再上皮化减少。qRT-PCR显示增殖标记Mki67、ECM基因（Col1a1, Fn1, Eln）和收缩性基因Acta2的表达降低。降低的Mki67、Col1a1和Acta2蛋白水平通过免疫荧光得到证实。值得注意的是，circMT-RNR2敲低显著降低了伤口组织中的Prdx3蛋白。同时，它抑制了抗氧化酶（Gpx3, Nqo1, Gclc, Sod1, Sod3, Gsr）和主抗氧化调节因子Nrf2的表达。
总之，这些结果表明circMT-RNR2在体内对伤口愈合至关重要，通过Prdx3稳定和保持线粒体氧化还原平衡起作用，从而保护细胞免受氧化应激诱导的损伤。
2.6 CircMT-RNR2促进人类体外伤口的愈合
为了评估我们发现的转化相关性，我们使用人类体外皮肤模型研究了circMT-RNR2在伤口修复中的作用。在该系统中，伤口被引入手术废弃的人类皮肤样本中，然后在标准培养条件下维持。这种方法保留了天然组织结构，允许在接近体内条件的环境中研究人类皮肤修复。
我们通过用si-CircMT-RNR2沉默或使用基于先前建立的线粒体circRNA表达方法的质粒过表达（OE）来调节体外伤口中的circMT-RNR2水平。qRT-PCR证实了人真皮成纤维细胞中circMT-RNR2的有效线粒体过表达而不影响MT-RNR2表达，以及体外模型伤口真皮中成功的circMT-RNR2过表达。
在功能上，沉默circMT-RNR2损害了组织收缩，而过表达促进了它。免疫荧光分析显示，敲低circMT-RNR2降低了真皮COL1A1和FN1的表达，而过表达增加了它们的水平。类似地，沉默circMT-RNR2降低而过表达增加了增殖标记MKI67。值得注意的是，PRDX3蛋白在circMT-RNR2沉默的伤口中减少，支持了circMT-RNR2在人类伤口修复过程中稳定PRDX3的作用。此外，qRT-PCR显示circMT-RNR2敲低抑制了抗氧化酶（GPX3, NQO1, GCLC, SOD1, SOD3, GSR）和主抗氧化调节因子NRF2，而过表达增强了它们的表达。
为了确定PRDX3是否介导circMT-RNR2在伤口修复中的作用，我们将circMT-RNR2过表达与PRDX3敲低相结合。PRDX3沉默在很大程度上消除了circMT-RNR2过表达诱导的促收缩效应，表明circMT-RNR2驱动的组织收缩需要PRDX3。一致地，circMT-RNR2诱导的COL1A1蛋白、增殖标记MKI67和抗氧化基因（GCLC, GSR, SOD1, SOD3和NRF2）的增加在PRDX3敲低后显著减弱。总之，这些发现将PRDX3确立为circMT-RNR2的关键下游效应器，并强调circMT-RNR2作为成纤维细胞驱动的皮肤修复的核心调节因子，具有治疗潜力。
3 讨论
线粒体编码的环状RNA（mecciRNAs）是一类新认识的ncRNAs，扩展了我们对线粒体如何调节细胞稳态和应激适应的理解。尽管已在人类和小鼠细胞中编目了数百种mecciRNAs，但只有少数被功能表征，每种都揭示了在线粒体生物学中的重要角色。本研究鉴定circMT-RNR2为伤口修复所必需的新型功能性mecciRNA。通过稳定抗氧化蛋白PRDX3，circMT-RNR2保障线粒体氧化还原稳态，从而支持对组织修复至关重要的成纤维细胞活性。其在DFUs中的缺陷损害成纤维细胞功能并延迟愈合，提供了第一个证据表明病理生理相关的mecciRNA有助于人类组织修复。
线粒体转录本合成为长的多顺反子RNA，然后主要通过RNase P和RNase Z的tRNA指导的切割加工成mRNAs、tRNAs和rRNAs。虽然tRNA标点模型解释了该过程的大部分，但非tRNA侧翼转录本和新发现的线粒体ncRNAs的存在表明替代的RNA加工途径。与核circRNAs通过反向剪接形成不同，mecciRNAs不太可能使用典型的剪接机制，后者在线粒体中不存在。值得注意的是，circMT-RNR2和许多其他mecciRNAs在其连接点含有保守的重复序列，可能促进线粒体RNA连接。尽管核线粒体DNA片段可能引起对circMT-RNR2基因组起源的疑问，但我们的数据显示抑制线粒体RNA聚合酶降低circMT-RNR2水平而不影响核RNAs，支持其线粒体起源。这些观察表明mecciRNAs通过独特且目前未表征的线粒体机制产生，值得进一步研究。
我们的数据显示，人真皮成纤维细胞中circMT-RNR2的表达是动态调节的，被生长因子如EGF和FGF2上调，但在高血糖或缺氧条件下被抑制。这种调节反映了核circRNAs的调节，表明circMT-RNR2不是转录副产物，而是一种响应性调节分子。在DFUs中，增殖成纤维细胞的缺失与EGF信号减少相关，而减少的FGF2进一步损害成纤维细胞活化和血管生成。结合DFUs敌对的代谢和缺氧微环境，这些缺陷可能共同抑制慢性伤口中的circMT-RNR2表达。
氧化还原稳态对伤口愈合至关重要，我们的发现表明circMT-RNR2通过互补的保护机制维持线粒体ROS平衡。CircMT-RNR2直接结合并稳定PRDX3，一种线粒体特异性ROS清除剂，在氧化应激下诱导，从而限制线粒体ROS积累。同时，circMT-RNR2耗竭增加mPTP开放，表明线粒体膜完整性维持受损。持续的mPTP开放使膜电位崩溃并促进进一步的线粒体ROS释放，建立氧化应激和线粒体功能障碍的正反馈循环。因为线粒体ROS使mPTP开放敏感，PRDX3依赖的ROS缓冲可能间接限制应激下的病理孔激活。总之，这些发现表明circMT-RNR2通过协调加强抗氧化防御和限制ROS驱动的mPTP开放，在糖尿病伤口的敌对微环境中保护成纤维细胞免受氧化损伤。与此概念一致，最近的研究报告额外的mecciRNAs调节线粒体ROS释放和mPTP活性，支持mecciRNAs作为线粒体应激信号调节因子的更广泛作用。
FOXM1可能代表线粒体氧化还原状态与核转录反应之间的额外联系。FOXM1是氧化应激程序的公认调节因子，其表达和活性响应ROS依赖性信号，并且它转录上调PRDX3以支持应激下的线粒体功能。因此，CircMT-RNR2可能通过蛋白质稳定和转录调节（可能通过FOXM1）来增强PRDX3水平。然而，circMT-RNR2如何影响FOXM1表达或活性仍有待确定，
