《Advances in Hematology》：Impact of Preanalytical Storage Time and Air Exposure on ROTEM and Coagulation Sample Stability
编辑推荐：
本文探讨了前分析阶段储存时间及试管内空气对ROTEM（旋转血栓弹力测定法）、常规凝血检测（APTT、INR）及血小板活化标志物（β-血栓球蛋白、sP-选择素）稳定性的影响。研究发现，在室温震荡保存条件下，枸橼酸盐抗凝样本的ROTEM参数、APTT及PTF1+2可稳定6小时，INR稳定48小时；而移除试管内空气并未延长样本稳定性。该研究为优化临床实验室前分析流程提供了关键数据，对提升检验质量、降低医疗成本具有重要意义。
摘要
本研究聚焦于临床检验关键环节——血液样本采集、储存及运输的前分析阶段，系统评估了储存时间与试管内空气暴露对粘弹性凝血检测（ROTEM）、传统凝血参数及血小板活化标志物的影响。通过对健康志愿者样本的严格控制实验，为优化实验室操作流程提供了实证依据。
1. 引言
前分析阶段的质量控制直接关系到临床诊断结果的准确性。常规真空采血管并非绝对真空，管内残留的微量空气与血液形成的界面可能激活凝血、补体及血小板。尽管普遍使用枸橼酸盐或EDTA等抗凝剂抑制血液生物级联反应，但ROTEM、INR（国际标准化比值）和APTT（活化部分凝血活酶时间）等检测仍被视为时间敏感性指标，需尽快分析。欧洲临床化学和实验室医学联合会（EFLM）基于临床结局、生物学变异数据及"当前最佳"方法学设定了分析质量目标，其中"最大允许偏倚"是评估样本稳定性或储存条件所致误差的关键指标。延迟分析或样本长时间室温储存可能引起血液成分改变，导致结果失真。近年来，ROTEM和血栓弹力图（TEG）等粘弹性凝血检测因能全面评估再钙化枸橼酸盐全血中的血浆凝血成分及血小板功能而广泛应用。然而，关于枸橼酸盐血液在粘弹性检测前储存时间的研究结论不一，现行指南建议ROTEM检测应在采血后2小时内完成。延长样本前分析储存时间有助于实现中心化实验室检测、减少患者奔波，但可能增加结果不确定性。本研究提出假设：适当延长前分析储存时间可行，且减少血-气界面可能降低体外止血过程激活。研究旨在明确时间、空气与血液样本在前分析阶段的相互作用，首要目标是评估储存时间与空气对凝血、血小板活化及溶血参数的影响，次要目标包括分析细胞死亡及比较溶血评估方法。
2. 方法
2.1. 血液采样
十名健康志愿者（五男五女，平均年龄42岁）经静脉采血至Vacuette枸橼酸钠凝血管和K2E EDTA管。标准采血后，部分试管保留血-气界面（标准管），另一部分通过精细操作完全充满血液以消除空气（全满管）。所有样本在室温（21-25°C）下于平板振荡器（250×g）中孵育模拟运输过程，分别于采血后0、2、4、6、24、48小时取样处理。EDTA样本离心后血浆存于-80°C；ROTEM检测前，枸橼酸盐样本轻柔重悬细胞。
2.2. ROTEM分析
枸橼酸盐样本37°C预热5分钟后，使用ROTEM Delta仪器及EXTEM、INTEM试剂检测凝血动力学。检测后样本离心分离血浆冻存。
2.3. 血浆凝血分析
枸橼酸盐血浆复融后，使用Sysmex CS-5100分析APTT和INR，采用Enzygnost F1+2试剂盒检测PTF1+2。
2.4. 血小板标志物
六名捐赠者的EDTA血浆解冻后，通过ELISA检测β-血栓球蛋白（BTG）和sP-选择素。
2.5. 血气分析
四名捐赠者的枸橼酸盐/EDTA样本（含/无空气）转入肝素化血气针，使用Radiometer ABL800 Flex分析仪检测pH、pCO2、pO2、碳酸氢盐、血红蛋白、钾、钙、葡萄糖及乳酸。
2.6. 溶血分析
六名捐赠者的EDTA血浆通过HemoCue Plasma/Low Hb系统、NanoDrop分光光度计（检测414 nm和600 nm吸光度）评估游离血红蛋白，并使用Atellica生化分析仪检测乳酸脱氢酶（LDH）活性以评估细胞裂解。
2.7. 数据处理与统计分析
采用重复测量双因素方差分析比较时间与试管类型的影响，计算Pearson相关系数。显著性水平设定为p < 0.05。结果以中位数（四分位距）或均值（95%置信区间）表示，并参照EFLM生物学变异数据库计算最大允许偏倚（0.375×总生物学变异）评估临床可接受性。
3. 结果
3.1. ROTEM
标准枸橼酸盐管中，EXTEM CT和CFT在48小时内波动于基线值11%以内；EXTEM α角、MCF及INTEM α角、MCF变化小于5%；INTEM CT和CFT6小时内变化小于10%，48小时内小于17%。EXTEM CFT在2小时后、EXTEM MCF在24小时后、EXTEM CT在48小时后超出最大允许偏倚。全满管中，EXTEM CFT和INTEM CFT在4小时后显著降低（p < 0.05），且EXTEM CFT、MCF、CT及INTEM CFT较早超出允许偏倚。
3.2. 凝血与纤溶
枸橼酸盐血浆中，APTT基线为25秒，6小时内稳定，24小时增加9%，48小时增加16%（p < 0.0001），24小时后超出最大允许偏倚（1.9%）。INR基线为1.0，48小时内变化小于3%，但2小时后即超出允许偏倚（1.3%）。PTF1+2基线为251 pmol/L，6小时内变化小于10%，24及48小时后显著降低23%（p = 0.01）。试管内空气存在与否对APTT、INR、PTF1+2均无显著影响。
3.3. 血小板活化
EDTA标准管中，BTG基线为63 ng/mL，2小时后激增395%，6小时内维持高位，24小时及48小时后进一步升高至1183%和2055%（p = 0.01）。sP-选择素基线为40 ng/mL，2小时内变化小于10%，24小时后增加32%（p = 0.03），4小时后超出最大允许偏倚。全满管与标准管间无显著差异。BTG与sP-选择素呈中度相关（r = 0.34）。
3.4. 血气与代谢物
枸橼酸盐与EDTA样本中，pH、葡萄糖随储存时间下降，乳酸、pCO2上升，钾在48小时后显著升高。绝大多数指标在2小时后即超出最大允许偏倚。两种抗凝剂样本变化模式相似，空气存在无显著影响。
3.5. 溶血与细胞死亡
HemoCue与NanoDrop检测显示EDTA血浆游离血红蛋白48小时内无显著变化，且二者强相关（r = 0.82）。LDH活性6小时内稳定，24及48小时后显著上升（p < 0.02），与BTG（r = 0.44）、sP-选择素（r = 0.33）相关，提示与血小板裂解有关。空气存在对溶血指标无影响。
4. 讨论
ROTEM参数在6小时内稳定性良好，部分参数可延至24小时，优于传统2小时建议，有利于实验室物流优化。但EXTEM CFT等参数较早超出允许偏倚，提示需谨慎评估临床可接受性。APTT、PTF1+2的6小时稳定性与INR的48小时稳定性为延长检测窗口提供可能，但需考虑运输震荡等实际因素。血气与代谢物需即时检测。血小板活化（BTG、sP-选择素）主要发生于采血初期，6小时内相对稳定。全满管未改善稳定性，可能与采血过程激活及操作干扰有关。溶血评估显示红细胞稳定性良好，但LDH升高提示需在6小时内离心分离细胞以防细胞损伤影响结果。
5. 结论
本研究证实，枸橼酸盐抗凝样本的ROTEM、APTT、PTF1+2及血小板标志物可稳定6小时，INR稳定48小时，移除空气未延长稳定性。EDTA样本溶血轻微，但LDH提示24小时后细胞损伤加剧，强调6小时内离心的重要性。该发现对简化实验室流程、提升偏远地区检测可行性具有实践意义。
