结构导向设计与合成选择性丁酰胆碱酯酶抑制剂

《Journal of Molecular Structure》：Structure-Guided Design and Synthesis of Selective Butyrylcholinesterase Inhibitors

本刊推荐：针对阿尔茨海默病现有胆碱酯酶抑制剂疗效有限的问题，研究人员通过结构导向设计开发新型苯并咪唑类选择性BChE抑制剂。先导化合物5IIa6展现对人源BChE的微摩尔级抑制活性（IC50=5.9 μM），兼具血脑屏障高渗透性和低细胞毒性，为AD治疗提供了新策略。

　　

随着全球人口老龄化加剧，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）作为最常见的神经退行性疾病，正成为日益严峻的公共卫生挑战。目前临床上使用的对症治疗药物主要依赖于胆碱酯酶（ChE）抑制剂，通过抑制乙酰胆碱（ACh）水解来缓解胆碱能缺陷。然而，现有的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂仅能带来有限的临床改善，且常伴随明显副作用，这促使科学家将目光转向了另一种胆碱酯酶——丁酰胆碱酯酶（BChE）。

有趣的是，在AD病程进展中，大脑中的AChE活性逐渐下降，而BChE活性却显著上升。特别是在疾病晚期，BChE可能取代AChE成为主要的胆碱酯酶靶点。这一发现为开发选择性BChE抑制剂提供了理论依据。马来西亚莫纳什大学的研究团队Christine Shing Wei Law、Zhe Ying Ha、Xavier Brazzolotto和Keng Yoon Yeong在《Journal of Molecular Structure》上发表的研究，正是基于这一背景展开的。

本研究采用结构导向的药物设计策略，以苯并咪唑这一具有多种生物活性的药效团为核心结构，通过系统修饰其1位和2位取代基，开发了一系列新型选择性BChE抑制剂。研究人员首先合成了两个系列的苯并咪唑衍生物，并通过体外酶活性筛选发现化合物5IIa对马源BChE（eqBChE）表现出亚微摩尔级的抑制活性（IC₅₀=0.4 μM）和超过13倍的选择性。

为了深入理解化合物与靶点的相互作用机制，研究人员通过X射线晶体学解析了5IIa与人源BChE（hBChE）的复合物结构（PDB ID: 9SPC）。晶体结构显示，5IIa的苯环与催化位点His438和Trp82产生π-π相互作用，而氧代吡咯烷环则位于Trp82上方的疏水口袋中。这一结构信息为后续理性药物设计提供了重要依据。

基于晶体结构分析，研究人员对5IIa进行了系统结构修饰，旨在提高化合物的稳定性和活性。他们将易水解的酯键替换为酰胺键，并引入芳香环和环己烷等刚性基团，合成了7个衍生物（5IIa1-7）。其中，化合物5IIa6（N-环己基甲基-1-(3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙基)-2-苯基-1H-苯并[d]咪唑-5-甲酰胺）表现出最佳的hBChE抑制活性（IC₅₀=5.9 μM）。

酶动力学研究表明，5IIa6是一种混合型抑制剂，既能与游离酶结合（竞争性抑制），也能与酶-底物复合物结合（非竞争性抑制）。其抑制常数K_i和K_is分别为2.05 μM和3.02 μM，表明该化合物对游离BChE具有更强的亲和力。这种双重作用机制相比单纯的竞争性抑制更具治疗优势，因为它可以在不同底物浓度下均有效抑制酶活性。

在药物特性评估方面，平行人工膜渗透性试验（PAMPA）显示5IIa6具有较高的血脑屏障穿透能力（P_e=1.45×10^-5cm/s），与阳性对照药物多奈哌齐相当。细胞毒性实验进一步证实，在50 μM浓度下，5IIa6对神经母细胞瘤（SH-SY5Y）和小胶质细胞（BV2）均未表现出显著毒性，显示出良好的生物相容性。

关键技术方法包括：采用四步合成法构建苯并咪唑衍生物；通过Ellman法进行胆碱酯酶抑制活性筛选；利用X射线晶体学解析蛋白质-配体复合物结构；采用酶动力学分析抑制机制；通过PAMPA模型预测血脑屏障渗透性；使用MTT法评估细胞毒性。

2.1. 苯并咪唑衍生物的合成

研究人员通过酯化、胺烷基化、硝基还原和最终缩合反应的四步合成路线，成功制备了两个系列的苯并咪唑衍生物。这些化合物在1位和2位具有不同的取代基，便于进行构效关系研究。

2.2. 合成化合物的胆碱酯酶抑制活性

初步筛选发现，在10 μM浓度下，含有1-丙基-2-吡咯烷酮和未取代苯基的化合物5IIa对eqBChE表现出完全抑制（>99%），IC₅₀值为0.40 μM，且对eqBChE的选择性是对eeAChE的13倍以上。

2.3. 5IIa与人源BChE结合模式的结构分析

通过X射线晶体学解析的hBChE-5IIa复合物结构显示，配体主要与催化位点的His438和Trp82发生相互作用，这与传统的以Trp231为主要作用位点的结合模式有所不同。

2.4. 5IIa的结构修饰

为提高化合物的稳定性和活性，研究人员对5IIa的酯侧链进行了系统修饰，包括延长烷基链、增加取代度以及将酯键替换为酰胺键等策略。

2.5. 修饰化合物的胆碱酯酶抑制活性

所有修饰化合物均对eqBChE表现出微摩尔级的抑制活性，其中5IIa2和5IIa1活性最强（IC₅₀分别为1.07和1.40 μM）。对hBChE的抑制活性以5IIa6最佳（IC₅₀=5.9 μM）。

2.6. 结合模式

酶动力学研究表明5IIa6是混合型抑制剂，能够同时作用于游离酶和酶-底物复合物，这种双重作用机制有助于在不同底物浓度下均保持抑制效果。

2.7. 预测的血脑屏障渗透性

PAMPA实验表明5IIa6具有较高的血脑屏障穿透能力，其有效渗透率与阳性对照多奈哌齐相当，预示着良好的中枢神经系统药物递送潜力。

2.8. 细胞毒性

细胞活力实验显示，在50 μM浓度下，5IIa6对神经细胞和小胶质细胞均未产生显著毒性，表明该化合物具有较好的安全性。

本研究成功开发了一系列基于苯并咪唑骨架的选择性BChE抑制剂，其中先导化合物5IIa6表现出优异的hBChE抑制活性、良好的血脑屏障穿透性和低细胞毒性。通过结构导向的药物设计策略，研究人员不仅获得了具有潜力的候选化合物，还通过晶体结构分析和酶动力学研究深入揭示了其作用机制。这些发现为开发新型AD治疗药物提供了重要理论基础和实验依据，标志着选择性BChE抑制剂研究领域的重要进展。未来研究将重点关注化合物的全面药代动力学特征评估，以进一步推动其向临床应用的转化。