通过测量其主要性质，来解析构成主要相变的各种事件，这些相变发生在主要含有阴离子脂质的中性脂质双层中

《Methods》：Disentangling the events that constitute the main phase transition of predominantly neutral lipid bilayers containing anionic lipids by measuring their macroscopic properties

脂质双层相变温度（Tm）受范德华力、氢键及质子解离影响，通过宏观技术（紫外-可见光谱、折射率）与DSC结合分析，发现Tm主要源于非极性区范德华力减弱，而极性区氢键及质子状态变化影响较小。

　　

Ramona Petko|Ivan Mari?|Barbara Pem|Danijela Bakari?

有机化学与生物化学系，Ru?er Bo?kovi?研究所，Bijeni?ka 54，10000 萨格勒布，克罗地亚

摘要

在脂质双层的主要相变过程中，由于碳氢链之间的范德华相互作用减弱以及极性头基团区域的水合作用增强，导致双层变薄。这一过程在特定温度（T_m）处达到峰值。确定T_m最常用的技术是差示扫描量热法（DSC），该方法能够直接且快速地提供所需信息，但无法揭示导致主要相变的分子层面细节。为了分离极性头基团区域中的氢键作用和（去）质子化对测量得到的T_m的影响，本研究使用宏观技术测定了含有阴离子脂质的双层（摩尔比为10:90）在pH值为4、7和9的Britton-Robinson缓冲液中的T_m。具体而言，通过温度依赖的UV–Vis光谱结合折射率测量，可以模拟主要相变过程中双层厚度（d）的变化。值得注意的是，氢键模式的变化显著影响了d的变化，而阴离子脂质的去质子化则没有这种影响。分子极化率在主要相变时出现急剧下降，但其变化幅度及其不确定性仅在阴离子脂质不与水环境发生质子交换的情况下才是可接受的，即pH依赖的（去）质子化会干扰T_m的精确测定。除了确定T_m外，这种新方法还使我们能够对影响T_m的各种因素进行排序：范德华相互作用 > 氢键作用 > （去）质子化。

引言

质子在细胞膜上的运输对于植物和动物细胞的能量产生至关重要，这一过程依赖于膜表面与周围环境之间的质子交换[1]。质子在溶液中的扩散遵循Grotthus机制：扩散速度快，扩散系数为9.3·10^?5 cm² s^?1，涉及质子在氢键水分子之间的跳跃。相比之下，质子沿膜表面的扩散速度较慢，受到膜内脂质分子以及深层界面区域水分子的影响，因此扩散系数为2·10^?7 cm² s^?1[2]。为了阐明模型脂质膜表面附近的质子扩散及其与溶液中的质子交换情况，不可避免地需要使用荧光标记的脂质[2],[3],[4],[5],[6],[7],[8],[9]。在这些研究中，发现了一个复杂的现象：在主要由阴离子1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸（DOPG）脂质构成的脂质体中，当周围介质的pH值接近DOPA的pK_a时，含有更容易被滴定的官能团（如1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸（DOPA）的脂质会加速膜表面与溶液之间的质子交换[3]。这不仅表明脂质的可质子化基团（无论是带负电荷还是中性的）可能作为质子收集器，还强调了在分子水平上无探针技术研究质子传输的必要性。

在这方面，Pashkovskaya等人对嵌入在两性离子1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）脂质双层中的脂肪酸（FA）的pK_a进行了大量研究[10]。通过改变周围介质的pH值来诱导不同链长FA与其水溶液之间的质子交换，并通过ζ电位测量确定pK_a，而DOPC脂质双层中质子化及去质子化FA的位置则通过分子动力学模拟确定。在报告所得pK_a值（均为约7 [10]）时，也应指出这些方法的局限性：ζ电位数据可能受到样品浓度、离子强度、稳定性或散射光干扰等多种因素的影响[11]，而传统的分子动力学模拟仅考虑恒定的质子化状态[10],[12]。

另一方面，在测定可滴定物质的pK_a时，可以使用差示扫描量热法[13]。尽管DSC不能直接提供关于研究物质的分子特征的信息，但它能揭示它们的热致性质。1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）被公认为理解双层相变、评估膜厚度和热力学协同性的标准参考脂质[14],[15],[16]。加热时，DPPC双层在过量水中会先从凝胶（L_β′）相转变为波纹（P_β′）相（约34°C T_p），随后在41–42°C（T_m）发生主要相变转变为流体（L_α）相[15]。预转变是一个低焓过程，表现为双层表面出现周期性波纹，波纹间距约为100–300 ?[17],[18],[19]。主要相变具有高度协同性，涉及链的熔化和无序化，伴随着分子面积增加约24%以及脂质双层变薄，后者主要是由于碳氢链之间的范德华相互作用减弱和极性头基团水合作用增强所致[20],[21]。因此，系统的任何变化都会反映在所关注的热致现象上，从而影响T_m的变化[13]。这一现象成为测定嵌入DPPC脂质双层中的棕榈酸（PA）的pK_a的依据[22]；这些样品悬浮在pH范围为5–11的缓冲液中，DPPC的T_m可以通过DSC测量轻松获得。此外，利用根据表面电位变化修改的Henderson-Hasselbach公式[23]，也得到了PA的固有pK_a值[22]。

除了差示扫描量热法（DSC）外，还可以使用光谱技术确定主要相变温度（T_m）[15],[24],[25]，这突显了过去三年中UV–Vis光谱的广泛应用。由于温度依赖的浊度变化，UV–Vis光谱在检测多层DPPC脂质体（MLV）的T_p方面表现出与DSC相当的灵敏度[26]；此外，它还能检测1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DPPE）多层聚集体的表面结构变化[27]，并间接揭示了阳离子疏水肽与混合脂质膜的相互作用模式及其解离动力学[28],[29]。Wang等人开发的光散射模型[30]不仅有助于从悬浮液的浊度确定脂质双层厚度，还能区分导致DPPC LUVs主要相变的各种因素，如范德华相互作用的减弱和极性头基团的水合作用增强[31]。因此，可以认为测量宏观性质（如浊度）有助于区分主要相变背后的各种机制，包括碳氢链之间的范德华相互作用减弱和极性头基团的水合作用增强，后者涉及氢键网络的结构和动态变化，以及可滴定官能团的质子化和去质子化。为此，我们在pH值为4、7和9的Britton-Robinson缓冲液中制备了以DPPC为主要成分的含阴离子脂质双层。作为阴离子脂质，我们使用了pH值高于4时带有净–1电荷的DPPG[32]、含有磷酸基团、羧基和氨基的DPPS（在中性pH下呈中性，在极高pH下呈净–2电荷），以及1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸（DPPA）（其磷酸单酯头基团含有两个可解离的质子，在低pH下呈净0电荷，在较高pH下呈净–2电荷）[33],[34]（图1）。通过温度依赖的浊度响应[35]结合折射率（n(λ)）测量，我们评估了氢键作用和（去）质子化对T_m值、双层厚度（d）[30]以及分子极化率（α）[36],[37],[38]的影响。T_m值均通过DSC获得，其结果反映了整个脂质层的热致性质，而不仅仅是特定区域（极性或非极性）的特性。

化学物质和脂质体制备

DPPC（脂质）、DPPG（钠盐，Avanti Polar Lipids）、DPPS（钠盐，Avanti Polar Lipids）和DPPA（钠盐，Cayman Chemical Company）以白色粉末形式购买（纯度≥99%）。它们的储备溶液在氯仿（CHCl₃，Carlo Erba）中制备，浓度为γ = 10 mg mL^?1，随后用于制备单层脂质囊泡（LUVs），具体摩尔比为：90% DPPC + 10% DPPG（PC/PG）、90% DPPC + 10% DPPS（PC/PS）和90%

通过量热法确定的相变温度：反映了整个脂质层中脂质分子之间的相互作用

在详细讨论PC/PG、PC/PS和PC/PA系统在不同pH下的DSC结果之前，首先需要讨论纯阴离子脂质的热致性质和相关结构特征。pH值高于4时，DPPG以阴离子形式存在[59]（图1），其链熔化行为与DPPC相似——在中性pH值的DPPG MLVs中，主要相变发生在约41°C，预转变现象也存在，尽管不太明显，但与波纹形成一致

结论

在这项研究中，我们使用DSC、温度依赖的UV–Vis光谱和折射率测量法，研究了pH值为4、7和9的Britton-Robinson缓冲液中PC/PG（90/10）、PC/PS（90/10）和PC/PA（90/10）脂质双层的主要相变。T_m值由DSC测定，其中包含了非极性区域变化（由于碳氢链之间范德华相互作用减弱）和极性区域变化（在T_m时水合作用增强）的贡献

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本文得到了克罗地亚科学基金会（项目编号：UIP-2020-02-7669）和Proof of Concept（PoC）第二轮资助（项目编号：NPOO.C3.2.R3-I1.05，“药物递送系统的结构表征新方法（NoStruDos）”的支持。R. P.和D. B.衷心感谢来自Ru?er Bo?kovi?研究所辐射化学与剂量学实验室（物理化学部门）的Tanja Jurkin，她协助我们使用了克罗地亚购买的Zetasizer Ultra（Malvern Panalytical）仪器