解析内溶素LysCPD7所承载的产气荚膜梭菌（C. perfringens）孢子结合域的功能

《Microbiological Research》：Deciphering the role of endolysin LysCPD7 harboring C. perfringens spore binding domain

产气荚膜梭菌噬菌体CPD7编码的endolysin LysCPD7通过C末端孢子结合结构域（SBD）抑制该菌孢子形成，突变后SBD活性降低但溶菌活性保留，为开发新型抗菌剂和诊断工具提供依据。

　　

Ha Eunsu | Shin Daeun | Ryu Sangryeol | Kong Minsuk

韩国首尔国立大学食品与动物生物技术系、农业生物技术系及农业与生命科学研究所

摘要

由于具有强大的杀菌活性，源自噬菌体的内溶素被认为是传统抗生素的有希望的替代品。尽管一些感染产孢细菌的噬菌体内溶素含有孢子结合结构域（SBD），但其生物学功能仍不清楚。Clostridium perfringens噬菌体CPD7产生的内溶素LysCPD7表现出很高的抗菌活性，能有效减少牛奶和牛肉汤中的C. perfringens污染。荧光检测和免疫金电子显微镜显示，LysCPD7缺乏C端细胞壁结合结构域，但含有一个定位在孢子皮层上的SBD。我们发现SBD中的E187K突变降低了孢子结合能力，同时保留了裂解活性。野生型CPD7的感染会降低C. perfringens的产孢效率，而携带SBD中E187K突变的突变体CPD7对产孢没有影响，这表明SBD可能在抑制C. perfringens产孢过程中起作用。我们的发现有助于合理设计有效的抗菌剂或诊断工具来控制C. perfringens，并为噬菌体与其产孢宿主之间的相互作用提供新的见解。

引言

Clostridium perfringens是一种革兰氏阳性、厌氧、产孢细菌，广泛存在于土壤、粪便以及人类和其他动物的肠道中（Mehdizadeh Gohari等人，2021年）。由于能产生多种毒素，C. perfringens是人类和动物气性坏疽及坏死性肠炎的主要原因（Camargo等人，2024年）。在美国，C. perfringens每年导致近一百万例食源性疾病，主要与食用储存不当或加热不足的肉制品有关（CDC，2011年）。全球范围内，C. perfringens相关疾病给家禽产业带来了巨大的经济负担，估计每年损失约60亿美元（Fu等人，2022年）。随着对饲料中抗生素使用的限制以及多重耐药C. perfringens菌株的出现，迫切需要替代干预策略（Venhorst等人，2022年）。

噬菌体（或称病毒）能够特异性感染并裂解细菌细胞，正成为对抗细菌病原体的有前景的生物控制策略。尽管多项研究表明C. perfringens特异性噬菌体可以有效减少食品中的污染（Noor Mohammadi等人，2022年；Tian等人，2022年），但它们对细菌孢子的作用有限，因为噬菌体只能感染代谢活跃的的营养细胞（Shymialevich等人，2024年）。C. perfringens孢子对环境压力（如高温、辐射和有毒化学物质）具有高度抵抗力（Mehdizadeh Gohari等人，2021年），并且可以在食品或人体胃肠道中萌发（Camargo等人，2024年）。孢子具有一层厚厚的皮层肽聚糖，位于孢子外壳蛋白和膜结合的孢子原生质（核心）之间（Al-Riyami等人，2016年）。这层皮层对于维持孢子脱水状态至关重要，从而有助于其代谢休眠和耐热性（Al-Riyami等人，2016年）。

噬菌体编码的内溶素（肽聚糖水解酶）在宿主细胞裂解周期的最终阶段释放。感染革兰氏阳性细菌的噬菌体通常产生由N端酶活性结构域（EAD）和C端细胞壁结合结构域（CBD）组成的模块化内溶素（Eugster等人，2011年）。有趣的是，感染产孢细菌的噬菌体往往具有能够结合宿主孢子的结构域。例如，Bacillus anthracis噬菌体Gamma产生的内溶素PlyG和Bacillus cereus噬菌体PBC2产生的内溶素LysPBC2在其催化区域都含有孢子结合结构域（SBD），使它们能够特异性识别并结合其相应细菌宿主的孢子，而对营养细胞无亲和力（Kong等人，2019年；Yang等人，2012年）。同样，针对Clostridium tyrobutyricum的噬菌体产生的内溶素CTP1L具有兼具细胞壁和孢子结合能力的C端CBD（Gómez-Torres等人，2017年）。虽然这些研究揭示了内溶素的新孢子结合活性，但它们在噬菌体感染过程中的确切生物学作用仍不清楚。

在这项研究中，我们探讨了来自C. perfringens特异性噬菌体CPD7的新内溶素LysCPD7的抗菌潜力，重点研究了其在受污染食品环境中对C. perfringens的裂解活性。为了研究LysCPD7的C端区域的作用，我们构建了mCherry融合的LysCPD7衍生物并进行了基于荧光的结合实验。这些融合蛋白不与C. perfringens的营养细胞结合，但显示出明显的孢子结合活性，其中SBD主要针对孢子皮层。为进一步阐明SBD的作用，我们进行了定向突变，生成了保留天然裂解活性但孢子结合能力降低的LysCPD7变体。其中一个名为LysCPD7_E187K的变体通过CRISPR-Cas系统被整合到CPD7噬菌体基因组中。值得注意的是，这种基因改造的噬菌体在感染过程中无法抑制C. perfringens的产孢。这些发现突显了SBD在阻止产孢中的关键作用，揭示了噬菌体-宿主相互作用的新方面，并为未来的治疗应用提供了宝贵见解。

部分片段

细菌菌株和生长条件

噬菌体基因组编辑使用C. perfringens FORC25作为宿主菌株，而噬菌体扩增使用分离株2722。培养物在37℃的脑心浸液（BHI）培养基中厌氧条件下过夜培养；在噬菌体基因组编辑过程中向C. perfringens FORC25培养物中添加了氯霉素（5μg/mL）。对于产孢，C. perfringens FD-1和分离株2722在流体硫糖醇（FTG）中过夜培养，然后转接至改良的Duncan和Strong（mDS）培养基中

C. perfringens噬菌体CPD7及其内溶素LysCPD7

我们从污水样本中分离出了C. perfringens特异性噬菌体CPD7，该噬菌体在多种C. perfringens菌株上形成了明显的菌斑（表S1）。透射电子显微镜（TEM）分析显示，CPD7具有规则的二十面体头部和短的非收缩性尾部（图S1A）。基因组测序显示，CPD7基因组包含18,958 bp，有25个开放阅读框（ORFs），G+C含量为29.12%（图S1B）。基因组分析表明，该噬菌体属于...

讨论

在这项研究中，我们分离出了C. perfringens噬菌体CPD7并表征了其内溶素LysCPD7。LysCPD7的裂解范围比其亲本噬菌体更广，并在包括牛奶和牛肉汤在内的多种食品基质中表现出强烈的抗菌活性，凸显了其作为C. perfringens生物控制剂的潜力。鉴于许多感染革兰氏阳性细菌的噬菌体内溶素的C端区域具有细胞壁结合结构域（CBD）的功能，我们...

未引用的参考文献

（疾病控制与预防中心（2011年）

CRediT作者贡献声明

Eunsu Ha：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、概念化。Minsuk Kong：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念化。Daeun Shin：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究。Sangryeol Ryu：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、概念化。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用了OpenAI ChatGPT 3.5来提高文章的可读性。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了韩国食品药品安全部（授权号：RS-2024-00332071）的资助。