《Microchemical Journal》：A biothiol-activated fluorescent probe for hemoglobin dynamic monitoring
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新型荧光探针TDA通过生物巯醇响应实现血红蛋白动态监测，其与血红蛋白的非共价相互作用使探针在病理环境下保持稳定，损伤时荧光恢复显著。
Jing Zhang|Yong-Bin Liu|Hong-Kai Bian|Xin-Yu Pan|Xiang Ding|Qing Wang|Wen-Bo Liu
扬州大学化学与材料学院，中国江苏省扬州市225002
摘要
血红蛋白（Hb）浓度的异常是多种病理状况的重要生物标志物。尽管有多种方法可以高度敏感地检测Hb，但目前仍缺乏在特定病理环境中动态监测Hb的有效工具。在此，我们开发了一种新型荧光探针（TDA），用于生物硫醇介导的Hb动态监测。TDA对多种生物硫醇具有响应性，尤其是对谷胱甘肽（GSH）的响应性更强。此外，虽然TDA本身对蛋白质和DNA没有显著响应，但经过生物硫醇激活的TDA（即TDA-OH）对牛血红蛋白（BHb）表现出良好的选择性荧光“关闭”响应。TDA和TDA-OH都具有良好的BHb结合能力，常见的商业药物对这种结合影响很小。非共价相互作用在稳定BHb与TDA/TDA-OH之间的相互作用中起着关键作用。由于这种稳定性，即使TDA被生物硫醇激活，生成的TDA-OH仍能稳定地嵌入BHb中，其荧光处于淬灭状态。当BHb受损时，TDA-OH的淬灭荧光会恢复，从而产生明显的荧光增强。这种级联响应特性使TDA具备了在含有过量生物硫醇的病理环境中特异性和动态监测Hb的潜力。
引言
血红蛋白（Hb）是红细胞中一种重要的含铁蛋白质，它在肺部结合氧气，将其输送到全身组织，并同时促进二氧化碳返回肺部排出[1]。Hb浓度的异常是多种病理状况的重要生物标志物，包括贫血、先天性心肺异常、心脏病、肿瘤过程、溶血状态以及肝肾损伤[2]、[3]、[4]。临床上，通常使用基于分光光度法的自动化血液分析仪来测量Hb。Hb电泳（用于检测异常类型的Hb）和高效液相色谱（HPLC）（用于精确分离和定量Hb）也是有价值的技术。此外，利用Drabkin溶液的氰化血红蛋白法是一种传统而准确的检测方法[5]。然而，这些方法主要适用于静态测量，难以捕捉Hb波动的动态特性。近年来，如比色传感器、基于荧光的传感器、电化学传感器、表面增强拉曼散射（SERS）传感器和表面等离子体共振（SPR）传感器等新兴技术为Hb检测提供了有希望的替代方法。这些方法具有多种优势，包括更高的灵敏度、更快的检测速度或便携性，以满足不同的临床和研究需求[6]、[7]、[8]。然而，这些技术在提供深入探索Hb在复杂疾病相关环境中的复杂动态和相互作用所需的卓越特异性和灵敏度方面仍存在不足，尤其是考虑到正常组织中也含有Hb[9]、[10]。
荧光探针方法是目前检测和可视化特定分子或生物过程的主要方法[11]、[12]、[13]。通过利用特定的分子识别生成可检测的荧光信号，这项技术能够通过针对与病理状况相关的生物标志物来实现高度敏感和选择性的疾病诊断[14]、[15]、[16]。在临床应用中，它已被用于各种诊断和治疗场景，如精确检测疾病标志物和实时手术导航[17]、[18]、[19]。然而，作为非酶蛋白生物标志物的Hb，在设计选择性和敏感性的探针方面存在挑战，尤其是在监测与Hb相关的疾病时，因为其广泛的生理分布以及需要克服复杂生物基质中的背景干扰。这些挑战还因铁的氧化还原状态波动而加剧，这需要强大的信号响应机制来确保在不同生理条件下的可靠检测。
目前，关于Hb荧光探针的研究仍然非常有限。尽管有报道称一些基于纳米的探针具有出色的Hb检测能力[20]、[21]、[22]，但它们的固有特性（如较大的尺寸、较慢的扩散动力学和有限的生物相容性）严重限制了Hb的动态监测。考虑到小分子探针在扩散速度更快、生物相容性更好以及可能对蛋白质动态监测具有更敏感响应方面的优势[23]、[24]，我们团队最近创新设计了一种依赖蛋白质结构的响应性荧光探针，专门用于Hb的动态监测[25]。然而遗憾的是，这种探针只能无差别地检测Hb。为了实现对Hb相关疾病的特异性监测，需要进一步改进和优化以提高探针的选择性和特异性。值得注意的是，一些与Hb相关的疾病（如癌症）表现出特定生物标志物的过度表达，包括生物硫醇水平的升高以及某些受体的表达失调[26]、[27]。这些特性为开发靶向荧光探针以实现精确的疾病检测和监测提供了有希望的机会[28]、[29]。受此启发，我们设计了一种新型的生物硫醇激活荧光探针TDA，旨在在含有过量生物硫醇的病理环境中实现选择性的Hb动态监测。
化学物质和设备
所有溶剂和试剂均从商业供应商处购买，未经进一步纯化即可使用。BHb（牛血红蛋白）、BSA（牛血清白蛋白）、胰蛋白酶（来自牛胰腺）、溶菌酶（来自鸡蛋白）、α-胰凝乳蛋白酶（来自牛胰腺）、γ-球蛋白（来自牛血液）和鲱鱼精子脱氧核糖核酸（hsDNA）由Solarbio Science and Technology Co., Ltd.（北京，中国）提供。其他溶剂和试剂则从Energy Chemical（上海）获得。
TDA的设计
生物硫醇，包括半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH），在许多生理和病理过程中起着关键作用[33]、[34]。生物硫醇的过度表达或异常积累与多种疾病的发病和发展有关[35]。例如，在癌症中，观察到许多癌症患者的生物硫醇水平升高，尤其是GSH。因此，一些探针被设计为包含能够与硫醇反应的功能基团。
结论
总之，成功开发了一种新型的生物硫醇激活荧光探针TDA，可用于在含有过量生物硫醇的病理环境中选择性地动态监测Hb。TDA被设计为一种ICT探针，包含一个2,4-二硝基苯氧基团作为其生物硫醇响应基团。TDA对多种生物硫醇具有响应性，尤其是对GSH的响应性最强。TDA本身对其他物质没有显著响应。
CRediT作者贡献声明
Jing Zhang：撰写 – 原始草稿，研究，正式分析，数据管理。Yong-Bin Liu：研究。Hong-Kai Bian：研究。Xin-Yu Pan：研究。Xiang Ding：研究。Qing Wang：撰写 – 审阅与编辑，可视化，软件，方法学，概念化。Wen-Bo Liu：监督。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了江苏省双创计划和扬州绿色扬金凤凰计划的支持。感谢西华医院的研究核心设施在分子模拟方面的协助。感谢扬州友谊医院在血红蛋白相关研究方面的支持。
