《Microchemical Journal》：Machine learning-assisted arginine modified copper nanozyme sensing array for detection of antioxidant phenolics
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抗氧化多酚检测面临结构多样性和复杂基质干扰挑战，本研究开发出具有三重酶样活性（漆酶/过氧化物酶/抗坏血酸氧化酶）的Arg调控铜基纳米酶，通过多酶协同催化和竞争性底物识别构建三通道传感阵列，实现双模式（比色/光热）多维指纹识别。机器学习分析显示该体系对8种典型抗氧化多酚检测准确率达100%，且在红酒、绿茶等复杂基质中仍保持高稳定性，为食品抗氧化多酚的快速无损检测提供新策略。
Jinyao Hu|Mengyang Li|Ruoshan Yang|Chenxu Bai|Bihe Chen|Jingyi Shen|Wengang Zhang|Wenzhi Tang|Zhonghong Li
西北农林科技大学食品科学与工程学院，中国陕西省杨陵市712100
摘要
抗氧化酚类化合物（APs）是植物源食品的重要质量标志物，但由于实际样品中多种酚类化合物的结构多样性和共存，对其进行快速、同时的区分仍然具有挑战性。本文报道了一种由精氨酸（Arg）调控的铜基纳米酶，该纳米酶具有可调节的铜（I）/铜（II）（Cu+/Cu2+）氧化还原状态，并表现出类似漆酶、过氧化物酶和抗坏血酸氧化酶的活性，进一步通过抗坏血酸氧化酶活性证明了其氧化还原催化功能的扩展性。通过合理利用多酶催化行为和竞争性底物相互作用，我们用单一纳米酶构建了一个简单的三通道传感阵列，整合了基于漆酶的光谱信号、基于过氧化物酶的光谱信号以及过氧化物酶相关的光热响应。这种双模式（比色/光热）传感策略生成了多维指纹图谱，有效放大了酚类抗氧化剂之间的细微结构差异。结合机器学习（ML）分析，在当前数据集和分割策略下，该纳米酶传感器阵列对八种代表性APs在内部保留的验证集上实现了100%的准确率。重要的是，在包括红葡萄酒、红茶和咖啡在内的复杂食品基质中，也展示了准确的区分和鉴定能力，且没有显著的基质干扰。这项工作提出了一种通过多酶纳米酶简化传感器阵列设计的策略，并为实际食品系统中抗氧化酚类化合物的基于指纹的鉴定提供了一个稳健、便携的平台。
引言
抗氧化酚类化合物（APs）是含有酚羟基的结构多样的有机分子。这些化合物通过清除自由基和螯合过渡金属来发挥抗氧化作用，从而提高食品的氧化稳定性并延长保质期[1]、[2]。APs的组成特征，包括其含量、化学多样性和结构比例，对栽培地区的气候和土壤变化非常敏感[3]。这些特性使得全面的多APs分析成为评估食品质量[4]、溯源[5]、[6]和真实性验证[7]、[8]的有效方法。因此，迫切需要开发高效、灵敏和可靠的方法来检测多种APs以满足这些需求。
目前，APs的测定主要依赖于先进的色谱技术，如液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）[9]、高效液相色谱（HPLC）[10]和气相色谱-质谱（GC–MS）[11]、[12]。尽管这些方法具有高灵敏度和分析准确性，但通常需要复杂的仪器、耗时的样品制备和专业操作。这些限制限制了它们在快速、现场或大规模筛查场景中的应用[13]、[14]。相比之下，比色法因其操作简单、成本低和视觉可读性强而成为有吸引力的替代方案[15]、[16]。传统的方法，包括Folin-Ciocalteu和4-氨基安替比林测定法，被广泛用于估算总酚含量；然而，它们的选择性有限且容易受到基质干扰，特别是在复杂食品基质中，常常导致假阳性或假阴性结果[17]、[18]。
为了解决这些挑战，基于纳米酶的传感策略近年来受到了越来越多的关注。纳米酶是模仿酶的纳米材料，具有高稳定性、可调节的催化性能和低成本等优点。其中，基于铜的纳米酶因其丰富的氧化还原化学性质和模仿多种氧化还原酶（如漆酶、过氧化物酶和多酚氧化酶）的能力而受到广泛研究。特别是，已经报道了许多具有高催化效率和传感灵敏度的基于铜的过氧化物酶或漆酶模拟纳米酶。近年来，研究证明了以铜为中心的活性位点在酚类氧化反应中的可行性[19]、[20]。之前的综述系统总结了用于分析和环境应用的类似漆酶的纳米酶和基于铜的纳米酶的发展[21]、[22]。
基于这些催化性质，纳米酶传感器阵列已成为区分和鉴定APs的强大工具。与依赖于与单个分析物特定“锁钥”相互作用的传统单一识别传感器不同，传感器阵列对多个目标产生交叉反应模式，从而实现基于指纹的识别。近年来，基于纳米酶的传感器阵列已成功应用于各种类别的APs分析，包括抗氧化酚类、环境酚类和茶多酚。例如，结合机器学习算法的多信号纳米酶传感器阵列能够区分食用油中的合成抗氧化剂，证明了数据驱动的指纹分析的有效性[23]。在食品相关应用中，基于多酚氧化酶或过氧化物酶活性的纳米酶传感器阵列已被广泛用于鉴定茶多酚、区分茶品种和检测茶叶掺假[24]、[25]、[26]。此外，整合比色、荧光和光热信号的多模态传感器阵列通过增加信息维度和提高对基质干扰的耐受性显著提高了区分性能。
尽管取得了这些进展，当前的纳米酶传感器阵列仍存在一些固有的局限性。许多报道的系统依赖于多种纳米酶材料或额外的探针来生成响应模式[27]、[28]、[29]，这增加了制造复杂性、成本和数据冗余，而基于单一酶模拟活性的传感器往往对结构相似的APs的区分能力有限。虽然已经探索了多模态传感策略，但生成多个信号输出通常依赖于引入外部功能组件，而不是源自单一纳米酶材料[30]、[31]。因此，开发一种能够从单一纳米酶产生多维传感信号同时保持高区分准确性的简化传感器阵列仍然是一个重要挑战。
为了解决这些限制，我们报道了一种由精氨酸（Arg）调控的铜基纳米酶，其中通过合理设计协调微环境来调节铜（I）/铜（II）（Cu+/Cu2+）的氧化还原状态，从而在单一材料中整合了类似漆酶、过氧化物酶和抗坏血酸氧化酶的活性，并进一步通过抗坏血酸氧化酶活性展示了催化功能的扩展性。通过利用多酶催化行为和抗氧化酚类与反应中间体之间的竞争性底物相互作用，我们用单一纳米酶构建了一个简化的三通道传感器阵列。该阵列结合了基于漆酶的光谱信号、基于过氧化物酶的光谱信号以及过氧化物酶相关的光热响应。这种双模式比色-光热传感策略生成了多维指纹图谱，有效放大了酚类抗氧化剂之间的细微结构差异。结合机器学习算法，所提出的纳米酶传感器阵列能够准确区分和鉴定八种代表性抗氧化酚类，并在包括红葡萄酒、红茶和咖啡在内的复杂食品基质中表现出稳健的性能。与之前报道的纳米酶传感器阵列相比，这项工作通过简化阵列设计并通过内在的多酶活性整合和数据驱动分析提高了区分准确性。
实验部分
完整的实验细节见支持信息。
R-cu-BTCs的表征
在室温下通过Cu2+配位合成了改性的铜基纳米酶（R-Cu-BTCs）。拉曼光谱用于探测金属-配体配位环境，并揭示了该系列中两种光谱上可区分的结构类型（图S1）。尽管制备了具有不同Cu-Arg比例的多种R-Cu-BTC组成，但拉曼光谱表明，从2R-Cu-BTC到4R-Cu-BTC的样品表现出几乎相同的
结论
在本研究中，成功合成了两种具有类似漆酶、过氧化物酶和抗坏血酸氧化酶活性的铜基纳米酶（1R-Cu-BTC和2R-Cu-BTC），并进一步展示了类似抗坏血酸氧化酶的活性，以突出Arg/三甲酸配位所实现的氧化还原多功能性。通过调节Arg配位比例，有效地调节了纳米酶的催化微环境和传感行为，同时保持了催化效率
CRediT作者贡献声明
Jinyao Hu：撰写——原始草稿，资金获取，正式分析，数据管理。Mengyang Li：方法学。Ruoshan Yang：数据管理。Chenxu Bai：方法学。Bihe Chen：软件。Jingyi Shen：软件。Wengang Zhang：撰写——审稿与编辑。Wenzhi Tang：撰写——审稿与编辑。Zhonghong Li：撰写——审稿与编辑，资源管理，项目协调。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
中国国家自然科学基金（32172327）资助了这项研究。作者感谢Scientific Compass的Dong Hui女士（
www.shiyanjia.com）在XPS分析方面提供的宝贵帮助。
