在许多生物过程和疾病诊断中，准确量化pH值至关重要[1]，[2]。细胞内pH值是调节细胞内多种基本生理和病理过程的关键指标，包括细胞增殖、凋亡和离子转运[3]，[4]，[5]。异常的细胞内pH值会破坏pH平衡，阻碍正常的细胞活动，导致各种疾病的发展[6]，[7]，[8]。据报道，在癌组织中，癌细胞内的糖酵解会导致pH值反转，使得癌细胞的细胞内pH值高于正常分化的细胞，而其细胞外pH值低于正常分化的细胞[9]，[10]。在这种情况下，实时pH监测有助于预防酸中毒或碱中毒，同时提供高空间分辨率、准确性和精确性的治疗策略的深入见解[11]，[12]，[13]。通常，pH监测依赖于pH试纸和光谱技术[14]，[15]。然而，对可靠的体内pH监测的探索已经持续了几十年。成本效益、制造便利性、可靠性和微型化仍然是体内pH测试的关键参数。高灵敏度荧光光谱因其细胞毒性而被广泛使用[16]，[17]。然而，诸如光程长度、温度变化和激发强度等多个因素可能会影响基于荧光的传感器的性能。此外，能够进行体内成像的荧光染料的缺点可能导致某些不可避免的副作用[18]，[19]。
因此，为了克服这些限制，基于微针的传感器最近受到了越来越多的关注，因为它们能够无痛地穿透细胞并在单细胞水平上进行靶向检测[20]，[21]，[22]。由于纳米微针穿刺只需几秒钟，测量和分析可以非常直接[23]，[24]，[25]。此外，传感器的小尺寸允许在受控环境中进行更精确的pH测量。到目前为止，大多数基于各种纳米结构的微针已被开发用于药物递送和疾病生物标志物检测[26]，[27]，[28]。pH传感器的应用受到的关注非常有限。然而，最近的研究表明，基于微针的电极也可以用于pH检测。Ganesh Kumar Mani等人通过选择性电沉积开发了针状pH传感器，使用氧化铱作为传感元件来实现脑脊液的pH检测[29]。此外，Zhou等人开发了一种基于显微灰度比的单细胞敏感比色pH检测方法[5]。这些检测方法为pH研究提供了潜在的途径。然而，真正的原位单细胞水平定量pH测量尚未被探索。因此，我们报告了一种基于纳米微针的直接、无标记、实时的pH监测方法。我们展示了首次使用氧化钨（WO?）和自参考Ag/AgCl基微针电极进行实时pH监测，并在Hela细胞中成功测试。
在这里，我们报告了一种对pH敏感的纳米微针WO?传感器。实验原理如图1A所示。在酸性环境中，阴极电流的增加和向更正电位的偏移表明形成了导电的HxWO?。WO?基电极的pH敏感性不仅受Nernst方程描述的热力学平衡控制，主要取决于在不同pH条件下WO?晶格内质子插层和脱插层的动力学。WO?电极的这种行为构成了其pH响应的基础，可以用以下方程描述：
WO 3 + xe ? + xH + ? H x WO 3
重要的是，这一过程的动力学强烈依赖于pH值。在较低的pH值下，增加的质子浓度显著降低了质子扩散的活化障碍，从而加快了界面电荷转移和体相插入动力学。相反，在中性到弱碱性条件下，质子的稀缺减缓了脱插层/插入过程，导致更受扩散控制的机制。此外，亚化学计量的WO???中的氧空位通过提供能量有利的位点来促进质子的容纳并缩短扩散路径，从而加速了质子的插入/提取动力学，并提高了氧化还原过程的可逆性，从而有助于在重复测量中观察到稳定和可重复的pH响应。因此，测量的电极电位反映了表面质子交换和体相扩散动力学之间的动态平衡，而不仅仅是纯粹的平衡驱动过程。这种在不同pH环境下的动力学稳健性支撑了自参考电极在真实细胞条件下的优异响应稳定性和低漂移。
DMEM（无血清培养基，含有高葡萄糖和青霉素-链霉素）、0.25%胰蛋白酶/2.2 mmol L?1 EDTA溶液、4′,6-二氨基-2-苯基吡啶（DAPI）、Red DLAT蛋白染料、DiO细胞膜绿染料均购自Keygenbio有限公司（南京，中国）。胎牛血清（FBS）购自Gibco。硼硅酸盐毛细管（外径：1.0 mm，内径：0.58 mm；长度：10.0 cm）购自Sutter Instrument。氧化铟锡（ITO）玻璃购自Kaivo光电技术有限公司（珠海，中国）。
所有光电流测量均使用CHI-660E电化学工作站（Chenhua，中国）记录。循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）在5 mm K3 [Fe(CN)6 ]/K4 [Fe(CN)6 ]和0.1 M KCl条件下使用CHI-660E电化学工作站记录。本研究中使用的硼硅酸盐纳米吸头由P-2000吸头拉拔机（Sutter Instrument，Novato，CA）制造，并使用Origin 2025软件绘制。扫描电子显微镜（SEM）表征在Apreo 2S（Thermo Scientific，美国）上进行。X射线衍射（XRD）图案使用D/max2500 VL/PC衍射仪（Rigaku，日本）获得。傅里叶变换红外光谱（FTIR，Nicolet IS50）。
所有玻璃毛细管均通过等离子体清洗器彻底清洁，以去除表面的有机杂质。在绘制纳米吸头之前，将硼硅酸盐毛细管浸入piranha溶液（98% H2 SO4 ，30% H2 O2 = 3.1）中1小时，然后用去离子水清洗，以确保毛细管中的任何残留piranha溶液都被清除。然后将纳米吸头在60°C下真空干燥后使用。程序包含以下参数：line1：Heat = 380，Fil = 1，Vel = 20，Del = 220，Pull = 180。
制备的激光拉拔纳米吸头固定在工作台上，与工作台平面成恒定的0°角。激光拉拔的毛细管通过磁控溅射镀上Ag和W层。使用了两组参数：电流 I = 100 mA和溅射时间 T = 400 s，以及电流 I = 160 mA和溅射时间 T = 500 s。随后，将制备的微针放入500°C的箱式炉中并在通风条件下保持3小时。确保W烧结成WO3 并自然冷却后，将它们取出并存放以备后用。具体机制如下：金属钨在空气或含氧气氛中表现出对氧的强亲和力。随着温度的升高，氧分子在钨表面的吸附、解离和扩散过程显著活化，使得氧化反应在热力学上非常有利。
2 W + 3O 2 → 2WO 3
参比电极的制备方法与我们之前报告的过程类似，但进行了轻微调整。使用银线作为阳极，铂线作为阴极，浸入0.1 M盐酸溶液中，并在0.4 mA/cm2 的电流密度下处理40分钟。阳极反应：Ag + Cl? → AgCl + e?
HeLa和A549细胞在DMEM中培养。人类乳腺腺癌细胞（MCF-7细胞）在RPMI-1640培养基中培养。两种培养基都补充了10%的热灭活FBS和相关的抗生素（100 μg/mL链霉素和100 μU/mL青霉素）。两种细胞系都在37°C的5% CO2培养箱中培养，环境湿润。
细胞用200 μM H2 O2 处理。从0分钟开始，每5分钟进行一次细胞成像。荧光强度比值被代入工作曲线，以计算凋亡过程中的pH变化。
HeLa细胞首先接种到细胞培养皿中并培养24小时。用含有细胞染色液的新鲜培养基替换旧培养基，然后将细胞在培养箱中培养30分钟。然后用缓冲液清洗细胞三次，并用含有125 mM KCl、20 mM NaCl、0.5 mM CaCl2 、0.5 mM MgCl2 、5 mM葡萄糖和其他营养物质的溶液处理细胞。培养30分钟后，使用激光共聚焦荧光显微镜捕获图像，并使用WO?自参考电极进行实验。
