《Molecular Immunology》：Mechanistic understanding of the protective effects of baicalein against the inflammatory response induced by
Toxoplasma gondii in Ana-1 macrophages
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小檗碱通过激活自噬并抑制cGAS-STING和NOD样受体信号通路减轻弓形虫感染诱导的巨噬细胞炎症反应。
王小娟|余正清|齐宇伟|姜宇辰|杨平龙|涂九苏|方楠|周潘|张莉
宁夏大学动物科学技术学院，中国宁夏银川
摘要
白藜芦醇是一种从黄芩（Scutellaria baicalensis）中提取的活性黄酮类化合物，属于唇形科植物。已有大量研究表明它具有抗氧化、抗炎和抗菌作用。然而，白藜芦醇在弓形虫（Toxoplasma gondii）感染引起的炎症中的抗炎机制尚未完全明确。本研究旨在系统探讨白藜芦醇对弓形虫感染相关炎症的调节作用及其分子机制。结果表明，白藜芦醇显著抑制弓形虫的增殖，减少炎症介质的产生，并降低促炎细胞因子的表达水平。进一步实验发现，白藜芦醇能有效阻断弓形虫刺激的Ana-1细胞中cGAS-STING和NOD样受体信号通路的过度激活，从而抑制炎症信号的放大。此外，白藜芦醇还能增强自噬相关蛋白的表达，促进自噬，减轻氧化应激引起的细胞损伤和炎症。总之，本研究表明白藜芦醇通过激活自噬和抑制cGAS-STING及NOD样受体信号通路的过度激活来发挥抗炎作用，有效抑制弓形虫感染引起的巨噬细胞炎症。这些发现为白藜芦醇在传染病中的潜在治疗应用提供了新的理论依据。
引言
弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种属于顶复门（Apicomplexa）的专性细胞内寄生虫，具有极广的宿主范围，几乎可以感染所有温血脊椎动物的有核细胞，包括哺乳动物、鸟类和人类。这一独特的生物学特性不仅使其成为弓形虫病的致病因子，也凸显了其在全球流行病学中的重要性。流行病学调查显示，全球约三分之一的人口对弓形虫呈血清阳性，表明其感染具有广泛的隐匿性和长期的公共卫生风险（Egorov等人，2021年；Lima和Lodoen，2019年；Augusto等人，2021年；Angel等人，2024年）。作为一种具有临床意义的人畜共患病，弓形虫病的跨物种传播模式复杂，对人类健康和动物疾病控制构成重大挑战。弓形虫是一种嗜神经的顶复门寄生虫，通过形成含有缓殖子的组织囊肿在免疫功能正常的宿主体内建立终生隐匿性感染。在免疫系统完好的个体中，这些隐匿性感染可被宿主免疫监视有效控制；然而，在免疫抑制（如HIV/AIDS、移植后免疫治疗或先天性传播）的情况下，弓形虫可能重新激活，常导致严重的临床表现，包括弓形虫性脑炎和播散性疾病，这些疾病通常与高死亡率相关（Hill和Dubey，2002年；Delgado等人，2022年）。机制研究表明，弓形虫感染通过模式识别受体（PRRs）激活宿主巨噬细胞的免疫监视，这些受体能识别寄生虫衍生的病原体相关分子模式（PAMPs）。其中，胞质DNA感应的cGAS–STING通路和NOD样受体（NLR）信号通路在寄生虫识别中起关键作用，分别通过TANK结合激酶1（TBK1）-干扰素调节因子3（IRF3）磷酸化和炎性小体组装引发下游炎症反应。这种由PRR介导的免疫激活会导致促炎细胞因子（如TNF-α和IFN-γ）的过度产生，从而在免疫易感宿主体内引发适应性不良的免疫反应，最终导致神经炎症和组织损伤（Jin等人，2024a年；Chu等人，2016年）。这种持续的隐匿状态不仅增加了慢性感染相关并发症的风险，也给临床管理带来了挑战。吡嘧甲胺和磺胺二甲嘧啶是目前治疗弓形虫感染的标准组合疗法，但这些药物存在严重的不良反应（Cheng等人，2022年）。因此，需要发现新的抗弓形虫抑制剂以用于弓形虫病的治疗。
巨噬细胞是炎症反应的核心调节者，在免疫反应的启动和调节中起着关键作用。大量证据表明，巨噬细胞的极化状态及其相关的炎症信号通路对多种病理状况（包括慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病）的进展具有决定性影响。这些免疫哨兵通过分泌促炎介质（尤其是TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子以及趋化因子）来启动炎症级联反应，共同塑造炎症微环境。值得注意的是，这些分泌机制的长期失调会导致炎症信号的持续放大，推动病理组织重塑和慢性炎症的持续（Hassanshahi等人，2022年；Li等人，2021年）。然而，过度的炎症反应可能导致组织损伤和病理重塑，最终对宿主造成损害（Chen Li等人，2023年；Yu等人，2024年；Tang等人，2024年）。因此，抑制巨噬细胞的异常激活可能是预防动物和人类因过度炎症引起的各种疾病的潜在疗法。
自噬是先天免疫的基本组成部分，是对代谢压力和环境挑战的关键细胞适应性反应。这一进化保守的过程通过溶酶体途径选择性降解受损的细胞质成分和功能失调的细胞器，在维持细胞稳态中发挥重要作用（Glick等人，2010年）。越来越多的证据表明，自噬在调节炎症和免疫中起着核心作用，它既能消除细胞内病原体，又能分离炎症信号通路的成分。这种多方面的免疫调节功能显著影响炎症相关疾病的起始、进展和病理结果（Hua等人，2019年；Cadwell，2016年；Wang和Wang，2021年）。然而，弓形虫感染期间自噬通量的调节动态仍需进一步研究。
白藜芦醇是一种从Erigeron breviscapus（菊科）和Scutellaria baicalensis Georgi中提取的生物活性黄酮类化合物，具有广泛的药理作用，包括强效的抗氧化、抗炎、抗血栓和抗菌活性（Wang和Ma，2018年）。药理学证据表明，白藜芦醇在多种病理情况下具有显著的抗炎作用，例如通过调节核因子κB（NF-κB）信号通路来减轻肺纤维化，从而抑制炎症级联反应的上调和上皮-间充质转化过程（Ling等人，2020年）。视网膜缺氧模型研究表明，白藜芦醇通过有效抑制NLRP3炎性小体的激活及其下游炎症级联反应提供显著的神经保护（Jingyuan等人，2018年）。尽管白藜芦醇的抗炎机制已在许多炎症相关疾病中得到充分研究，但其在弓形虫感染诱导的炎症级联反应中的精确分子靶点和调节通路仍需进一步阐明。
在本研究中，我们详细探讨了白藜芦醇对巨噬细胞中炎症、自噬以及cGAS-STING和NOD样受体信号通路相互作用的影响和机制。结果表明，白藜芦醇通过增强自噬过程和抑制cGAS-STING及NOD样受体通路的异常激活来减轻炎症。这些发现为白藜芦醇作为抗炎剂的潜力提供了新的见解，并为弓形虫相关疾病的预防和治疗提供了创新策略。
细胞系和昆虫品系
我们的实验室将Ana-1小鼠巨噬细胞和Vero上皮细胞系保存在液氮中。作为弓形虫研究的国际参考标准，T. gondii RH品系由南京农业大学的李向瑞教授的研究小组慷慨提供。Tgactin和TgGAP45抗体均在我们实验室制备（Zhou等人，2025年）。
仪器和材料
实验使用倒置显微镜（型号H4–200，Olympus，日本）进行
白藜芦醇处理对Ana-1细胞的存活率没有显著影响
使用CCK-8检测方法评估了不同浓度（0–10 μM）的白藜芦醇处理24小时后对Ana-1细胞存活率的影响。结果显示，2.5至10 μM浓度的白藜芦醇对细胞存活率没有显著影响（P > 0.05），表明该浓度范围对Ana-1细胞没有明显的细胞毒性（图1）。基于这些结果，后续实验使用了2.5 μM、5 μM和10 μM的白藜芦醇。
讨论
白藜芦醇具有抗炎活性（Ma等人，2013年；Ning等人，2023年），但其在弓形虫感染期间调节巨噬细胞先天免疫反应的精确分子机制尚不完全清楚。特别是它是否参与多种模式识别受体（PRR）相关的信号通路仍缺乏系统研究。基于弓形虫感染巨噬细胞的体外模型，本研究旨在探讨其潜在作用
结论
本研究揭示了白藜芦醇通过促进自噬和抑制弓形虫感染过程中cGAS-STING及NOD样受体炎症通路的过度激活来调节巨噬细胞炎症反应的免疫调节机制，为弓形虫病的预防和治疗提供了新的理论基础。
作者声明
我，王小娟，确认题为“白藜芦醇对弓形虫在Ana-1巨噬细胞中诱导的炎症反应的保护作用的机制理解”的论文是我原创的研究成果。该论文的全部或任何部分均未提交给其他地方发表。我确认：所有贡献，包括文本、数据、图表和想法，均为我的原创成果，或通过适当的引用和参考文献得到了正确归因。
CRediT作者贡献声明
张莉：写作 – 审稿与编辑、资源准备、方法学、资金获取。方楠云：实验研究。周潘：软件操作。杨平龙：软件操作。涂九苏：实验研究。齐宇伟：数据管理。姜宇辰：软件操作。王小娟：写作、方法学、数据分析、数据管理。余正清：方法学。
资助
本研究得到了中国国家自然科学基金（资助编号：32560844）和宁夏国家自然科学基金（资助编号：2024AAC03119）的支持。
利益冲突声明
作者声明，本研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。所有研究活动均独立完成，未受到外部资金或商业影响，且没有任何因素影响研究设计、数据收集、分析或论文撰写。
致谢
我们感谢中国南京农业大学的李向瑞教授提供了T. gondii RH品系（I型）。
