《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Development of CRISPR/Cas9 Construct for Targeted Mutagenesis of
callose synthase 7 Gene in Indonesia’s Mandarin Citrus Genotypes Toward Managing Huanglongbing Disease
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柑橘黄龙病抗性研究：基于CRISPR/Cas9的CalS7基因敲除技术构建载体并成功转化7株 Indonesian mandarin品种，通过Sanger测序验证靶向突变，发现非靶向SNP位点，为培育抗病品种奠定基础。
Kristianto Nugroho | Mia Kosmiatin | Tri Joko Santoso | Agus Purwito | Dewi Sukma | Ali Husni | Chaireni Martasari | Alina Akhdiya | Hadi Mohammad Yusuf | Atmitri Sisharmini | Aniversari Apriana | Reflinur Reflinur
印度尼西亚茂物16680，Dramaga校区，IPB大学农学院植物育种与生物技术研究生项目
摘要
Huanglongbing（HLB）是一种极具破坏性的疾病，威胁着全球的柑橘种植园。该病与“Candidatus Liberibacter asiaticus”细菌的存在有关。这种细菌会感染柑橘的韧皮部组织，导致由“callose synthase 7”（CalS7）基因编码的钙质积累。虽然钙质的积累旨在阻止细菌的传播，但最终会导致韧皮部堵塞和坏死，从而干扰光合产物的运输并严重降低产量。为了解决这一问题，CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了一种突破性的方法，通过敲除CalS7基因来提高柑橘植物对HLB感染的抵抗力并减轻韧皮部损伤。本研究重点设计和构建了一个基于pDIRECT_21A的CRISPR/Cas9载体，用于针对印度尼西亚柑橘基因型中的CalS7基因进行靶向突变。该载体通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）转入胚叶节中，通过Sanger测序确认了突变结果。通过农杆菌进行的遗传转化成功产生了7株阳性转化体，这些转化体通过Cas9特异性引物进行了PCR验证。Sanger测序显示，所有转化体柑橘中的非同义SNP突变均发生在CalS7基因内部，但位于引导RNA（gRNA）序列之外。进一步的研究需要分析这些转化体中CalS7基因的表达情况及其抗性变化，这可能显著促进柑橘作物的发展。
引言
Huanglongbing（HLB）是全球柑橘种植者面临的重要问题之一。在亚洲地区，该病与一种来自变形菌门（Proteobacteria）α亚群的革兰氏阴性、无法培养的细菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”有关[1]。这种耐热病原体通过亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri Kuwayama）作为媒介传播[2]，或者通过将受感染的接穗嫁接到健康的砧木上传播[3]。在印度尼西亚，该病也被称为柑橘脉部韧皮部退化（CVPD），首次报道于20世纪50年代的爪哇岛[4]。该病会导致多种症状，如植株生长受阻、叶片出现斑驳黄化、叶脉木栓化（有时会被误认为是营养缺乏的症状）、果实变小且颜色暗淡、果瓣不对称以及果实脱落[2],[5],[6]。该病可能导致产量损失30%至100%[7]。
据认为，韧皮部组织中钙质（β-1,3-葡聚糖）的沉积是HLB感染导致柑橘植株受损的主要原因[8],[9]。在病原体感染过程中，钙质的沉积可以阻止细菌向其他组织的扩散，但同时也会阻塞筛管孔隙，从而抑制光合产物向其他植物器官的运输，进而抑制植株的生长和产量[11]。钙质的生物合成受一组基因的调控，包括“glucan synthase-like”（GSL）[12]和“callose synthase”（CalS）[13]。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中已鉴定出12个callose synthase基因，先前的研究[14],[15]表明CalS7基因在韧皮部钙质沉积中起关键作用。一项针对柑橘的研究[16]显示，在接种后120天和360天时，HLB感染柑橘中的CalS7基因表达显著增加。
CRISPR/Cas9基因编辑技术有望用于敲除CalS7基因的活性，从而培育出新的抗HLB柑橘品种。该技术已被广泛应用于柑橘植物，特别是敲除CsLOB1[17],[18],[19]和CsWRKY22[20]基因的活性，这些基因与柑橘溃疡病（由Xanthomonas citri subsp. citri引起）的易感性相关。此外，还有研究利用CRISPR/Cas9技术在 Ponkan 柑橘中敲除CalS7基因[21]，使用的实验材料为合子和核胚。另一种利用CRISPR/Cas9增强柑橘抗性的方法[22]是敲除ACCELERATED CELL DEATH 2（CsACD2）基因，该基因产生的蛋白质与Candidatus Liberibacter asiaticus的SDE15蛋白（CLIBASIA_04025）相互作用，从而抑制植物的免疫系统并增加其易感性[23]。
作为赤道地区生物多样性丰富的国家，印度尼西亚拥有许多本地柑橘基因型，包括Keprok柑橘（Citrus reticulata Blanco）和Siam柑橘（Citrus nobilis L.），这些基因型被归类为HLB易感品种。据报道，印度尼西亚超过30%的柑橘种植园受到HLB的侵害[24]。然而，通过杂交进行传统柑橘育种以提高抗性存在诸多挑战，如无融合生殖和多胚现象、不亲和性、不育性、高杂合度以及漫长的幼年期[25],[26]。因此，需要采用CRISPR/Cas9等生物技术手段来克服这些问题。本研究旨在设计和构建一个基于pDIRECT_21A的CRISPR/Cas9载体，用于印度尼西亚柑橘基因型中的CalS7基因靶向突变。该载体通过农杆菌转入胚叶节，突变结果通过Sanger测序得到确认。这种方法在印度尼西亚尚未得到广泛应用，但其潜力值得进一步探索，有望为未来的柑橘育种工作带来帮助。通过CRISPR/Cas9技术对CalS7基因进行靶向突变，旨在敲除其在HLB感染中的关键作用，从而改善本地柑橘品种的抗性，为其未来的育种计划提供抗性种质资源。
遗传材料
本研究使用了四种柑橘基因型作为遗传材料，包括来自西婆罗洲Sambas的Keprok Terigas、来自东爪哇Malang的Keprok Batu55、来自西婆罗洲Pontianak的Siam Pontianak以及来自北苏门答腊Karo的Siam Madu。这些未成熟的柑橘果实由印度尼西亚东爪哇Malang的BRMP Jestro（柑橘和亚热带水果农业组装与现代化机构）提供。
CRISPR/Cas9-gRNA-CalS7构建及克隆过程
在NCBI数据库中查询CalS7的mRNA序列，对应的登录号为XM_006484852，代表C. sinensis的callose synthase 7类似物（LOC102620841），其转录本变体X5。使用Citrus基因组数据库进行BLASTn分析后，发现NCBI中的mRNA序列与orange1.1g022398m位点上的基因具有98.78%的相似度，该基因全长为2,294个碱基对（bp）。
讨论
CRISPR/Cas9是一种适用于多种物种的基因编辑工具，特别适用于那些具有高杂合度、无融合生殖或多胚现象的植物，这些特性使得传统育种方法难以适用。CRISPR/Cas9技术通过Cas9酶和单导向RNA（sgRNA）两个主要成分来切割目标DNA[44]。因此，sgRNA序列的设计至关重要。
结论
本研究成功构建了基于pDIRECT_21A载体的CRISPR/Cas9-gRNA-CalS7载体。通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）成功完成了遗传转化，共获得了7株阳性转化体柑橘苗，这些转化体通过Cas9特异性引物进行了PCR验证。其中6株转化体来自Keprok Terigas基因型，通过EHA105菌株进行转化并浸泡30分钟获得。
CRediT作者贡献声明
Reflinur Reflinur：撰写、审稿与编辑、数据分析。
Kristianto Nugroho：撰写初稿、方法设计、数据分析、概念构建。
Mia Kosmiatin：撰写初稿、验证、监督、方法设计、资金争取、概念构建。
Atmitri Sisharmini：撰写、审稿与编辑、验证、数据分析。
Aniversari Apriana：撰写、审稿与编辑、验证、数据分析。
Dewi Sukma：撰写初稿。
利益冲突声明
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究部分由Riset dan Inovasi untuk Indonesia Maju (RIIM)项目以及国家研究与创新机构（BRIN）下属的农业与食品研究组织（Rumah Program）内部研究计划资助。作者感谢BRMP Biogen提供实验室设施，以及BRMP Jestro提供用于研究的柑橘遗传材料。
