分离与鉴定Bacillus velezensis Bac302菌株及其对引起五味子（Schisandra chinensis）叶枯病的Alternaria tenuissima菌的生物防治潜力

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Isolation and identification of Bacillus velezensis Bac302 and its biocontrol potential against Alternaria tenuissima causing leaf blight on Schisandra chinensis

长春花叶斑病生物防控研究中，从辽宁种植区根际土壤分离出Bac302菌株，经16S rRNA和gyrB基因系统发育分析鉴定为Bacillus velezensis。实验室和田间试验显示该菌株对 Alternaria tenuissima 抑制率达92.4%和71.6%，通过破坏病原菌细胞膜及诱导植物系统抗性实现双重抑菌机制。

　　

丁小杰|秦业全|刘子扬|刘志国|李冰|李子波|周如军

沈阳农业大学植物保护学院，中国辽宁省沈阳市110866

摘要

五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill）是一种具有极高药用价值的传统中药。然而，由Alternaria tenuissima引起的叶枯病严重影响了五味子的产量和品质，使其成为栽培过程中最主要的病害之一。生物防治被认为是一种高效、生态安全且可持续的策略。本研究在五味子的根际土壤中筛选出一种对A. tenuissima具有显著抑制作用的生物防治菌株Bac302，其抑制率达到81.78%。通过形态观察以及基于16S rRNA和gyrB基因序列的系统发育分析，鉴定出该菌株为Bacillus velezensis。离体叶片保护试验和田间试验表明，Bac302在控制五味子叶枯病方面的效果分别为92.4%和71.6%，显示出其在田间应用中的巨大潜力。此外，B. velezensis通过直接和间接机制发挥生物防治作用：直接机制是Bac302显著影响了A. tenuissima的菌丝和孢子的正常发育；间接机制则是通过破坏其细胞膜的完整性来抑制A. tenuissima的生长和致病性。结果表明，B. velezensis可作为有效的生物防治剂用于控制五味子的叶枯病，具有广泛的应用前景。

引言

五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill）属于五味子科（Schisandraceae），其干燥成熟的果实是主要药用成分[1,2]。由于具有多种健康益处（如补肾养脑、保护消化系统、调节内分泌和免疫系统[3]），这种植物在临床医学中得到广泛应用。为了满足市场对药用植物日益增长的需求，五味子的种植规模不断扩大[4]。然而，在商业化种植过程中，由于生长环境变化、种植密度过大和单一作物种植等原因，出现了一系列病害。其中，由Alternaria tenuissima引起的五味子叶枯病已成为影响其产量和品质的最严重病害之一[5]。该病害主要侵害叶片，叶片上的病斑根据位置和大小进行分类：初期表现为圆形或近圆形的小褐色斑点，后期这些小斑点会合并形成不规则的大斑块。病斑最初出现在叶片的尖端或边缘，逐渐蔓延至叶片中部和边缘，最终形成大片褐色斑块。在严重情况下，叶片会干枯、开裂并脱落，导致果实萎蔫[6]。目前，化学药剂仍是控制五味子叶枯病的主要手段[7]，但过度依赖化学农药带来了环境污染、有害生物产生抗药性以及农药残留等问题[8]。因此，迫切需要探索创新、高效且环保的防治方法。

多项研究表明，生物防治是替代化学农药、实现植物病害环保控制的有效策略[9,10]。这种方法符合人们对传统中药（TCM）产品安全性的关注和需求，也与公众日益关注的中药产品安全性问题相契合。利用微生物（如Trichoderma属、Streptomyces属、Bacillus属和Pseudomonas属）来保护作物免受多种病原体侵害是生物防治的重要组成部分[[11], [12], [13], [14]]。例如，Trichoderma asperellum在控制Valsa pyri方面表现出显著效果，抑制率达到78.96%[15]；Streptomyces cavourensis作为生物防治剂可有效抑制Phytophthora nicotianae的活性[16]；Pseudomonas protegens在多种实验条件下能有效抑制Rhizopus oryzae的生长[17]；Bacillus atrophaeus通过产生特定脂肽具有防治棉花根腐病的效果[18]。总之，用于生物防治的多种微生物菌株不仅对多种植物病原体具有显著效果，还展示了开发环保、可持续的综合有害生物管理策略的潜力。

作为生物防治细菌的代表，Bacillus属因其独特的生物学特性和广泛的应用潜力而受到广泛关注[19]。研究表明，Bacillus属能产生多种结构多样的拮抗化合物，如肽类、脂肽、细菌素和聚酮类化合物[20]。这些代谢产物不仅直接抑制病原体生长，还通过多种机制发挥抗菌作用。例如，Bacillus subtilis能增强土壤中的氮固定能力并分泌抑制病原体生长的代谢物[21]；Bacillus amyloliquefaciens能诱导宿主植物产生系统抗性，提高其对番茄细菌性萎蔫的抵抗力[22]。Bacillus velezensis因能产生多种次级代谢物并具有广谱抑菌活性而被广泛应用于植物病害的生物防治[23]。

为确保中药产品的质量和安全，将生物防治技术应用于药用植物的病害管理具有重要的实际意义。目前关于五味子叶枯病的生物防治研究较少。本研究的目的是分离并筛选出对A. tenuissima有效的拮抗菌株，并通过形态观察和系统发育分析进行鉴定；评估其在离体叶片和田间条件下的防治效果；同时探讨该拮抗菌株的生物防治机制。本研究旨在为五味子叶枯病的环保管理提供理论和技术支持，为中药植物病害的生物防治研究提供参考。

部分内容

抑制A. tenuissima的生物防治菌株的分离与筛选

从中国辽宁省五味子种植区的根际土壤中收集了90份土壤样本。采用稀释平板法从这些土壤样本中分离微生物[24]，并将稀释后的土壤悬浮液分别接种在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）和营养琼脂（NA）培养基平板上[25]。在25°C下培养2天后，根据菌落的形态特征进行筛选

生物防治菌株Bac302的分离与鉴定

从五味子种植区的根际土壤样本中获得了11株对A. tenuissima抑制率超过50%的拮抗菌株。其中，Bac302对A. tenuissima的抗菌活性最强，抑制率为66.35%（图1A）。进一步通过菌丝生长速率法检测了Bac302发酵液对A. tenuissima的抗菌活性

讨论

药用植物作为驯化历史相对较短的特种农作物，在栽培系统中存在固有的脆弱性，因其野生起源而易受多种病原体侵害[41,42]。在栽培过程中，常大量重复使用化学农药来维持产量，但这与环保要求相悖

结论

总之，从五味子的根际土壤中筛选出一种对A. tenuissima具有高效抑制作用的生物防治菌株Bac302，并鉴定其为B. velezensis。Bac302的广谱抗真菌特性表明其在控制植物真菌病害方面的应用潜力。离体叶片和田间试验均表明，Bac302能显著降低五味子的叶枯病发生率。需要进一步研究其

CRediT作者贡献声明

丁小杰：撰写初稿。秦业全：数据验证与整理。刘子扬：实验研究。刘志国：实验研究。李冰：实验研究。李子波：方法设计及概念构建。周如军：项目监督、资金获取及概念规划。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2024YFD1600600）和辽宁省科技专项（2023JH1/10400021）的资助。