Calonectria caudovesiculata sp. nov.，一种新的桉树叶枯病病原体，其特征为尾部鳍状的水疱以及多基因位点系统发育分析结果

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Calonectria caudovesiculata sp. nov., a new leaf blight pathogen of Eucalyptus distinguished by caudal-fin-shaped vesicles and multilocus phylogenetic analyses

真菌在寄主叶片上形成鱼尾状孢子囊，常规培养基无法检测，分子鉴定确认新物种Calonectria caudovesiculata，揭示传统培养法诊断局限。

　　

Sabyasachi Banerjee|Nitika Bansal|Nitika Negi|Shweta Bhimta|Shailesh Pandey

印度德赫拉敦ICFRE-森林研究所森林保护部门，森林病理学学科

摘要

在研究印度北部Eucalyptus的Calonectria叶枯病（CLB）过程中，从受症状影响的叶片中分离出了真菌菌株。这些菌株在标准合成培养基上始终无法产生孢子，即使在强制孢子形成的条件下也是如此。尽管存在这种诊断上的困难，但致病性测试表明这些菌株在商业Eucalyptus克隆上引发了严重的CLB症状，这凸显了基于常规培养的真菌诊断方法的一个关键局限性。值得注意的是，所有诊断性的无性形态结构都仅在叶片病变处产生，包括独特的尾鳍状 vesicles，这是Calonectria属中以前未报道过的形态特征。多基因位点系统发育分析将这些菌株归为一个得到充分支持的新谱系，并在此将其命名为Calonectria caudovesiculata，它是Calonectria tonkinensis的姐妹群，成对同源性指数（PHI）测试未显示与近缘类群的重组证据。总体而言，这些发现表明，仅依赖基于培养的方法可能会掩盖具有生态和经济意义的真菌多样性，因此需要将宿主来源的形态特征（特别是稳定的在植物体内的诊断特征）与分子数据结合起来，以实现准确的分类、早期疾病诊断和有效的疾病管理策略。

引言

Calonectria属（子囊菌门，壳孢菌纲，假壳孢目，拟盘多毛孢科）包括历史上在采用“一种真菌 = 一个名称”规则之前被归类为Cylindrocladium无性形态属的物种，是一类多产的植物病原真菌，影响全球335多种宿主，包括观赏植物、水果作物、林业物种和农产品[1]，[2]，[3]。随着其宿主范围的扩大[3]，这些真菌以引起叶枯病、茎基部和根部腐烂、枝条枯萎、猝倒病和插条腐烂而闻名，尤其是在高价值的观赏园艺生产系统中，常常导致巨大的经济损失[4]。在林业宿主中，Eucalyptus物种尤其容易受到感染，Calonectria叶枯病（CLB）被认为是主要Eucalyptus种植国家中最严重的疾病之一，包括印度[5]。

在印度北部，CLB迅速成为一种主要威胁，特别是在高密度的Eucalyptus苗圃和幼林中，温暖的温度、高湿度、遮荫和长时间的叶片湿润为病原体的繁殖和疾病传播创造了非常有利的环境。受感染的叶片最初会出现小而圆形或不规则的浸水状病变，这些病变迅速扩大并融合成广泛的坏死区域，导致逐渐发展的叶枯病（图1A–1C）、过早落叶、茎部坏死（图1D），在严重情况下还会导致植株大量死亡[3]，[5]，[6]，[7]，[8]。高发病率和严重程度显著降低了苗圃的生产力，并影响了野外种植的成功，最终导致生长和生物量积累减少。此外，CLB造成的生理压力增加了宿主对次级病原体和非生物胁迫因子的敏感性，从而加剧了其整体影响。因此，CLB对印度的Eucalyptus栽培构成了严重限制，带来了重大的经济挑战，并威胁到人工林系统的长期可持续性。最近，来自比哈尔邦和北阿坎德邦的农民联系了作者，报告了Eucalyptus苗圃和种植园中的大规模死亡情况，并寻求疾病诊断和管理的科学指导。此外，这些真菌最近也被报道影响印度北部的其他重要经济作物[9]，[10]，[11]。在这种情况下，准确的分类鉴定对于可靠地区分具有重叠形态特征但致病性、宿主特异性和流行病学行为不同的密切相关的物种至关重要，从而能够进行精确诊断、采取有效的检疫措施并制定有针对性的管理策略。

近年来，将经典形态学与多基因位点系统发育分析相结合的研究不断揭示了Calonectria内部更大的多样性，目前已确认141个物种[2]，[3]，[12]，[13]。根据Calonectria鉴定的推荐指南[12]，印度记录了几种新的分类单元和新物种[3]，[5]，[7]，[8]，[9]，[10]，[11]，这突显了尤其是在Eucalyptus种植广泛的北部亚热带地区丰富的但研究不足的多样性。同时，其他影响Eucalyptus的叶部病原体的反复出现以及它们表现出的重叠症状[14]，[15]，[16]进一步复杂化了田间诊断工作。这种复杂性的增加强调了定期、严格的监测以及详细形态学检查和基于序列的鉴定在准确界定病原体多样性和有效管理疾病爆发方面的必要性。

在我们对Eucalyptus CLB的持续研究中，从严重受害的叶片中分离出了许多类似Calonectria的真菌菌株；然而，大多数菌株在标准和严格的孢子形成条件下都无法产生孢子[17]，[18]。在健康的Eucalyptus叶片上进行的致病性测试一致再现了典型的CLB症状，所有诊断性的无性形态特征都在叶片病变处出现，包括形成类似鱼尾鳍的独特 vesicles。因此，本研究旨在根据目前接受的Calonectria物种鉴定指南[12]对这些独特的菌株进行描述。

部分内容片段

真菌分离

2022年9月，从印度北阿坎德邦德赫拉敦Shisham Bara的20株Eucalyptus植物上收集了表现出CLB症状的叶片。切下小块组织（2–4 mm²），包括受感染的叶片和相邻的健康叶片组织，用1%次氯酸钠表面消毒1分钟，用无菌蒸馏水冲洗三次，然后用无菌滤纸吸干。随后将组织接种在添加了链霉素（100 μg）的土豆葡萄糖琼脂（PDA）培养基上。

分类

Calonectria caudovesiculata S. Banerjee, N. Bansal, N. Negi, S. Bhimta & S. Pandey 新种，MycoBank MB861503，图1E–T。

词源：种加词caudovesiculata源自拉丁语cauda（尾部）和vesiculatus（具有 vesicles），指的是形状像鱼尾鳍的 vesicles。

属于Calonectria cylindrospora物种复合群（CCYSC）。

诊断：在培养基中无法繁殖；其特征是在受感染的Eucalyptus植物体内产生独特的尾鳍状 vesicles。

讨论

本研究记录了一种高度致病性和分类学上独特的Calonectria物种，这种物种挑战了传统的基于培养的方法来界定该属内的物种。这种新分类单元在体外无法繁殖，所有诊断性的无性形态特征都仅表达在受感染的宿主组织上。这种严格的宿主依赖性孢子形成方式在比较仅从人工培养基上描述的分类单元的形态测量数据时需要谨慎，同时也突显了这种方法的限制。

结论

C. caudovesiculata新种的确认完善了CCYSC内的现有物种概念，表明在传统的、依赖培养的分类框架下，某些致病性分类单元可能未被发现。本研究表明，诊断性形态特征可以仅在植物体内表达，将其与基于DNA的分析相结合可以实现可靠的物种界定。除了其分类学意义外，C. caudovesiculata的鉴定还强调了

CRediT作者贡献声明

Sabyasachi Banerjee：撰写——原始草稿、方法论、研究、正式分析、数据管理。Nitika Bansal：撰写——原始草稿、方法论、研究、正式分析、数据管理。Shailesh Pandey：撰写——原始草稿、监督、方法论、正式分析、概念化。Nitika Negi：撰写——原始草稿、方法论、研究、正式分析、数据管理。Shweta Bhimta：撰写——原始草稿、方法论、研究、正式分析，

未引用的参考文献

[36]。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

本研究中分析和生成的DNA序列数据可在GenBank中找到，访问编号见手稿和补充表1。

伦理批准

本文不包含任何由作者进行的涉及人类参与者或动物的研究。

资金支持

感谢印度德赫拉敦的印度林业研究与教育委员会（ICFRE）提供的财政支持。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢ICFRE-森林研究所所长提供的必要研究设施。