赭曲霉毒素A在有机溶剂中的耐受模式及纳米抗体的作用

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Tolerance patterns of ochratoxin a nanobody in organic solvents

纳米抗体在有机溶剂中的耐受性及结构-功能关系研究。通过Dc-ELISA、光谱分析和分子对接，系统评估OTA纳米抗体在甲醇、乙醇等8种溶剂中的耐受阈值（20%-60%），发现甲醇耐受性最佳，二甲基甲酰胺导致完全结构紊乱，揭示溶剂主要通过氢键作用影响框架残基而非抗原结合域，为复杂基质检测和突变体设计提供理论依据。

　　

陈曦杨|杨英英|徐万珍|熊浩|冯璐璐|李永树|肖小月|蔡武丹|刘欢|吴秦|侯建军|刘喜霞

湖北省野菜资源保护与利用重点实验室，湖北师范大学，湖北省黄石市435002，中国

摘要

从复杂食品基质中提取霉菌毒素用于免疫测定通常需要有机溶剂，这可能会影响抗体的完整性和检测灵敏度。本研究旨在探讨一种特异性针对赭曲霉毒素A（OTA）的纳米抗体在有机溶剂中的耐受性模式，阐明其结构稳定性与功能活性之间的关系。通过直接竞争性酶联免疫吸附测定（Dc-ELISA）、荧光光谱、紫外-可见光吸收光谱、傅里叶变换红外光谱和分子对接技术，系统分析了该纳米抗体在八种有机溶剂中的耐受阈值、抗体活性保留率及结构变化。结果表明，该纳米抗体在甲醇、乙二醇、甘油、丙酮和二甲基亚砜中的耐受性较高（耐受阈值为40%–60%），而在乙腈和二甲甲酰胺中的耐受性较低（耐受阈值分别为20%和10%）。抗体活性保留率和光谱分析结果显示，甲醇对纳米抗体的结构和功能损伤最小；丙酮严重破坏了纳米抗体的结构及其核心功能域；乙腈可能通过非结构机制影响抗体活性和耐受性；二甲甲酰胺则导致其构象发生剧烈变化，引起结构完全紊乱、活性急剧丧失，耐受性最差。分子对接结果表明，有机溶剂主要通过与纳米抗体框架残基的氢键相互作用，而不会占据其核心抗原结合区域。本研究阐明了该纳米抗体在有机溶剂中的耐受机制，为其在复杂样品检测及耐溶剂突变体设计提供了理论基础。

引言

赭曲霉毒素是一类主要由曲霉菌和青霉菌产生的次生代谢产物，对人类和动物健康构成重大威胁[1]、[2]、[3]。其中，赭曲霉毒素A（OTA）是最具毒性和分布最广的霉菌毒素[4]。它常见于谷物、豆类、葡萄酒和猪肉等日常食品中，并通过食物链在人体内积累[5]。OTA具有多种毒性作用，包括肾毒性、肝毒性、遗传毒性、生殖和发育毒性、免疫毒性以及致癌性[6]、[7]。国际癌症研究机构将其列为2B类致癌物。此外，受真菌污染的谷物通常发芽和生长受阻，严重影响农作物产量。因此，灵敏高效的OTA检测方法至关重要。现有的OTA检测方法包括直接竞争性酶联免疫吸附测定（Dc-ELISA）、荧光光谱、高效液相色谱（HPLC）和电化学传感器[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。ELISA基于抗原与抗体的特异性结合，具有低成本、高通量、高灵敏度和操作简便等优点[16]。由于设备要求较低，ELISA已成为大规模筛查食品中OTA残留物的关键方法。

纳米抗体是骆驼科动物重链抗体中的可变域[17]。与传统多克隆和单克隆抗体相比，纳米抗体具有更小的分子量、更高的稳定性、更好的耐受性、优异的抗原结合能力和较高的表达产量[18]、[19]、[20]。这些特性使其成为食品安全检测中传统抗体的有力替代品。已开发出OTA纳米抗体-纳米荧光素酶融合蛋白，用于咖啡中的免疫测定[21]；一种突变型纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白被应用于新的酶级联放大免疫测定方法，可灵敏检测咖啡中的OTA[22]；基于纳米抗体和废弃蛋壳衍生的Au/CaCO₃杂化材料的电化学发光免疫传感器可用于超灵敏检测OTA[23]。这些研究表明，OTA纳米抗体在快速筛查、高灵敏度定量和安全监测方面具有广泛应用前景。在样品预处理过程中，常使用甲醇和乙腈等有机溶剂以提高毒素提取效率[24]、[25]、[26]，但这些溶剂可能破坏抗体的空间构象并降低其结合活性，从而降低检测灵敏度甚至导致检测失败。与传统抗体相比，纳米抗体对有机溶剂具有显著的耐受性，基于纳米抗体的ELISA方法简单易用，无需干燥提取液或重新溶解。然而，目前尚未系统阐明纳米抗体对有机溶剂的耐受模式。

本研究采用Dc-ELISA方法测定了OTA纳米抗体在八种有机溶剂（甲醇（MeOH）、乙醇（EtOH）、乙二醇（EG）、甘油（GLY）、丙酮（ACE）、乙腈（ACN）、N,N-二甲甲酰胺（DMF）和二甲基亚砜（DMSO）中的耐受阈值。根据结果，选择了四种代表性有机溶剂（MeOH、ACE、ACN、DMF）进行进一步分析。通过Dc-ELISA测定纳米抗体在有机溶剂中的活性保留率，并利用荧光光谱、紫外-可见光（UV–Vis）吸收光谱和傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析其二级和三级结构的变化。同时进行分子对接模拟，探讨纳米抗体与有机溶剂的结合机制。

化学试剂与材料

OTA纳米抗体由本实验室制备；OTA-BSA和OTA纳米抗体-HRP由黄石兰图生物技术有限公司制备，其制备过程参考了先前的研究[21]、[27]、[28]。OTA标准品购自Pribiolab工程有限公司；TMB（3,3,5,5-四甲基联苯胺）底物溶液由黄石兰图生物技术有限公司提供；ANS（8-氨基-1-萘磺酸）购自上海阿拉丁生化公司

OTA纳米抗体在有机溶剂中的耐受性

以往的研究通过ELISA分析纳米抗体在不同浓度有机溶剂中的结合活性或IC₅₀值来评估其耐受性，但未明确其耐受阈值[32]、[33]。本研究通过Dc-ELISA测定了OTA纳米抗体在八种有机溶剂中的耐受阈值（图1）。

随着有机溶剂浓度的增加，IC₅₀值也随之升高，表明纳米抗体的耐受性逐渐降低

结论

研究结果表明，OTA纳米抗体对有机溶剂的耐受性顺序为：MeOH > ACN > ACE > DMF。其背后的机制是：甲醇对纳米抗体的结构和功能损伤最小；ACE严重破坏了纳米抗体的结构及其活性，尤其是核心结构；ACN可能通过非结构机制影响抗体活性和耐受性；DMF对其构象产生显著影响，导致结构严重紊乱

术语表

MeOH：甲醇；EtOH：乙醇；EG：乙二醇；GLY：甘油；ACE：丙酮；ACN：乙腈；DMF：二甲甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；Dc-ELISA：直接竞争性酶联免疫吸附测定；UV–Vis：紫外-可见光；FTIR：傅里叶变换红外；IC₅₀：半数抑制浓度；BI_max

未引用的参考文献

[29], [30], [31]

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了湖北省中央政府引导的地方科技发展项目（项目编号：2024BSB020）、黄石市科技创新团队（项目编号：CXPT2023000007）、湖北省教育厅科研计划重点项目（项目编号：D20222503）以及湖北省野菜资源保护与利用重点实验室（项目编号：EWPL202103、EWPL202515）的支持。感谢黄石兰图生物技术有限公司的范阳先生的协助。