一种由硝基还原酶触发的近红外荧光探针，用于原位乳腺癌的选择性成像

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A nitroreductase-triggered NIR fluorescent probe for selective visualization in orthotopic breast cancer

硝基还原酶（NTR）作为乳腺癌缺氧代谢的关键酶，DHM-NO?探针通过近红外（880 nm）荧光激活实现高灵敏度检测，克服传统探针的波长限制，兼具体内成像兼容性和抗干扰能力。

　　

小雨万|思思王|品仪马|欣畅

吉林大学第二医院乳腺外科，中国长春130041

摘要

硝基还原酶（NTR）在乳腺肿瘤的缺氧代谢中起着关键作用，是评估肿瘤侵袭性和治疗反应的重要指标。然而，由于现有探针的光物理特性有限，尤其是其较短的发射波长和较小的斯托克斯位移，NTR活性的可视化仍然具有挑战性。本文报道了一种近红外（NIR）激活型荧光探针DHM-NO₂，该探针通过将具有较大斯托克斯位移的荧光团DHM-OH与硝基苯基识别单元结合而成。DHM-NO₂的背景荧光可忽略不计；但在NTR的催化下会发生还原反应，从而引发自毁性断裂并释放DHM-OH，后者在590 nm激发下会发出880 nm的荧光。该探针的检测限为25.6 pg/mL，具有优异的选择性，并且可以快速激活。DHM-NO₂能够区分MCF-7乳腺癌细胞和正常的MCF-10 A细胞，抗ROS/RNS的干扰，并对还原代谢的药理调节作出响应。在原位乳腺癌模型中，DHM-NO₂能够快速产生肿瘤特异性的荧光，肿瘤与正常组织的荧光比率显著增加。抑制剂、缺氧增强剂和氧合处理进一步证实了其依赖于NTR的激活机制。综上所述，DHM-NO₂是一种灵敏的NIR-I探针，可用于监测乳腺癌中的NTR活性，并且与常规荧光仪器高度兼容。

引言

乳腺癌是全球女性中最常见且威胁生命的恶性肿瘤之一[1]。早期识别肿瘤微环境中的分子变化对于改善治疗结果至关重要[2]、[3]、[4]。硝基还原酶（NTR）是一种黄素依赖性酶，在缺氧肿瘤组织中过度表达，在肿瘤代谢和药物耐药性中起着关键作用[5]、[6]、[7]。研究表明，NTR活性与肿瘤进展、侵袭性和对生物还原前药的反应密切相关[8]、[9]。这使得它成为乳腺癌早期诊断和治疗评估的重要生物标志物[10]、[11]。因此，开发灵敏、准确且生物相容的原位监测NTR活性的工具具有临床意义。

已经开发了多种分析技术用于NTR的检测，包括电化学、色谱和酶联测定[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。然而，这些方法通常受到复杂的样品制备、较低的实时能力和空间分辨率的限制。荧光成像是一种有吸引力的替代方法，因为它具有高灵敏度、非侵入性以及实时可视化生化过程的能力[18]、[19]、[20]。已经报道了许多针对NTR的荧光探针，包括那些基于硝基芳香族基团的探针，这些基团在酶促还原下会产生荧光[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。尽管取得了这些进展，大多数现有探针仍存在一些局限性：(i) 发射/激发波长较短，导致探针无法克服生物自荧光；(ii) 斯托克斯位移较小，导致准确度低且需要复杂的信号收集方法；(iii) 需要NIR-II（1000–1700 nm）波长的探针以实现深层组织穿透，而这通常需要专门的且昂贵的仪器，大多数实验室无法配备。

为了克服这些局限性，最近报道的荧光团DHM-OH具有较大的斯托克斯位移和强的近红外发射特性，是设计高性能激活型探针的有希望的平台[27]。在这项工作中，我们通过将DHM-OH与硝基苯基识别单元结合，开发了一种新的NTR响应型荧光探针DHM-NO₂。在NTR的酶促还原作用下，硝基被转化为氨基衍生物，从而恢复DHM-OH报告分子的荧光。由于DHM-OH本身的光物理特性，所得探针的最大激发波长为590 nm，发射波长为880 nm，且斯托克斯位移较大。值得注意的是，880 nm的发射波长位于常规NIR-I窗口内，可以使用标准荧光光谱仪进行检测[28]。这有助于避免NIR-II成像试剂相关的仪器限制。这些特性共同赋予DHM-NO₂更高的信噪比、更深的成像深度以及与常规实验室设备的更好兼容性。进一步使用DHM-NO₂在原位乳腺癌模型中监测了与NTR相关的微环境变化。本研究旨在确立DHM-NO₂作为NTR活性检测工具的潜力。

DHM-NO₂的合成

DHM-NO₂的合成路线如图1所示。

前体DHM-OH的合成遵循先前报道的程序[27]。¹H NMR（600 MHz，DMSO-d₆）δ 8.86 (d, J = 14.3 Hz, 2H), 8.64 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 8.47 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 8.34–8.29 (m, 4H), 8.20–8.16 (m, 2H), 8.04–8.01 (m, 2H), 7.76 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.61 (s, 2H), 4.88 (d, J = 6.9 Hz, 4H), 1.63 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 1.34 (s, 9H)。¹³C NMR（151 MHz，DMSO-d₆）δ 157.29, 150.20, 141.12, 138.63, 137.46, 134.44, 133.63,

DHM-NO₂的光谱特性和检测机制

首先使用紫外-可见吸收（图2A）和荧光光谱（图2B）研究了DHM-NO₂的光物理特性。在PBS缓冲液（10 mM，pH 7.4）中，该探针在约590 nm处显示出弱吸收带，在近红外区域几乎没有发射。这表明硝基苯基基团可以通过电子抽取有效抑制DHM-OH荧光团的荧光。在与NTR（10 μg/mL）和NADH（100 μM；酶促反应所需的辅因子）共孵育后

结论

总之，我们开发了DHM-NO₂，这是一种含有硝基苯基触发基团和NIR发射荧光团DHM-OH的NTR响应型荧光探针。该探针的背景信号极低，但在酶促激活后，在880 nm处产生强烈的NIR-I发射，且斯托克斯位移较大。实验表明，DHM-NO₂在生理pH和温度下的性能最佳。在这些条件下，其信号在10分钟内达到最大值。此外，其

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。