一种基于新型肽的AIE探针，用于高选择性和超灵敏地检测肝素及其应用

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A novel peptide-based AIE probe for highly selective and ultrasensitive detection of heparin and its applications

本研究开发了一种基于四苯乙烯（TPE）标记五肽（Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-NH2）的荧光探针TPE-GRGRG，用于高选择性和灵敏度的肝素检测。该探针在DMSO/HEPES缓冲体系中表现出132 nm的大斯托克斯位移和显著的聚集诱导发光（AIE）特性，检测限低至0.30 nM，可在活细胞和斑马鱼幼虫中进行成像，并成功应用于便携式检测设备。

　　

曹新林|李世阳|蒲春梅|熊世毅|王鹏

中国西华师范大学化学与化学工程学院，四川省化学合成与污染控制重点实验室，四川省南充市石达路1号，637009。

摘要

肝素是一种高硫酸化的线性糖胺聚糖，具有抗凝血特性，其过量使用可能导致多种疾病。因此，开发出灵敏的检测技术以准确检测肝素至关重要。本文报道了一种基于四苯乙烯（TPE）标记的五肽（Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-NH₂）的新型肽基荧光探针（TPE-GRGRG），用于高效且灵敏地检测肝素。TPE-GRGRG在DMSO/HEPES缓冲液混合物中表现出较大的斯托克斯位移（132 nm）和典型的聚集诱导发射（AIE）特性。在肝素存在下，TPE-GRGRG的荧光强度显著增强，响应时间小于30秒，检测限低至0.30 nM。一系列表征实验表明，TPE-GRGRG与肝素通过静电相互作用形成纳米聚集体，包括荧光光谱、紫外-可见光谱（UV–Vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、圆二色性（CD）、ζ电位、动态光散射（DLS）测量和荧光寿命分析，这些作用限制了分子内的旋转并触发了荧光增强。TPE-GRGRG能够在宽pH范围内检测肝素，并具有良好的生物相容性，成功应用于活细胞和斑马鱼幼体的肝素成像。此外，本研究还建立了基于拭子测试的检测平台，用于视觉定性分析和智能手机RGB分析，实现了便携式和可视化的肝素监测，检测限为0.93 μM。最后，在0.1%胎牛血清中也能检测到肝素，检测限为1.46 nM。TPE-GRGRG为肝素的即时检测提供了一种可靠的策略，在临床诊断和生物传感中具有潜在的应用价值。

引言

肝素是一种高硫酸化的线性糖胺聚糖，由于其强负电荷，在多种生理过程中起着关键作用，尤其是在抗凝血机制中[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。作为一种广泛用于临床实践的天然抗凝血药物，肝素在心血管手术、血液透析以及血栓性疾病的预防和治疗中具有不可替代的地位[6]、[9]、[10]、[11]。然而，肝素的剂量需要严格控制，因为偏离治疗范围可能导致严重的临床并发症，如出血、血小板减少症、高钾血症和骨质疏松症[3]、[11]、[12]。因此，建立准确、快速和灵敏的肝素检测方法对于确保用药安全和治疗效果具有重要意义。

传统的肝素检测主要依赖于凝血功能测定，如活化凝血时间（ACT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）和抗Xa活性测定[13]、[14]。此外，还开发了基于毛细管电泳、高效液相色谱和电化学分析等技术的检测方法[15]、[16]、[17]、[18]。尽管这些方法在临床和实验室环境中很有用，但它们通常存在程序复杂、分析时间长、灵敏度不足、易受干扰以及依赖大型仪器等局限性，从而限制了其在生物成像和临床监测中的应用[表S4]。近年来，随着荧光传感技术的进步，许多基于肽和聚集诱导发射（AIE）材料的荧光探针成为肝素检测的研究热点，因为它们具有高灵敏度、快速响应、操作简单和可视化等优点[3]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。值得注意的是，AIE活性荧光探针在聚集状态下表现出显著增强的发射，有效避免了传统荧光团常见的聚集引起的淬灭（ACQ）效应，从而提高了检测结果的可靠性和准确性[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]、[43]。此外，基于肽的探针在肝素识别和成像方面显示出巨大潜力，因为它们具有良好的水溶性、低毒性和令人满意的生物相容性[20]、[21]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]、[43]。

在这项工作中，我们开发了一种新型荧光探针TPE-GRGRG，该探针使用四苯乙烯（TPE）标记的五肽（Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-NH₂），用于在含有5% DMSO的10.0 mM HEPES（pH 7.4）缓冲系统中高效选择性地识别肝素。结果证实，肝素在纳米摩尔浓度下显著增强了TPE-GRGRG的荧光强度，表明该探针的构建使得肝素的检测具有很高的灵敏度。有趣的是，TPE-GRGRG在DMSO/HEPES混合溶液中随着水含量的增加表现出特征性的聚集诱导发射（AIE）行为。基于TPE-GRGRG对肝素的高选择性，我们进一步使用多种分析技术研究了其荧光增强机制，包括傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、荧光寿命测量、圆二色性（CD）光谱、紫外-可见光谱吸收光谱、动态光散射（DLS）分析和ζ电位分析。此外，细胞和斑马鱼幼体的荧光成像实验结果证实TPE-GRGRG具有优异的膜渗透性和低细胞毒性，能够在活体生物中实现肝素的荧光成像。

材料与设备

本研究涉及的所有材料和仪器细节均详细列在补充材料中。

合成与表征

AIE型肽探针TPE-GRGRG通过固相肽合成（SPPS）方法制备（方案1）。详细的合成步骤见补充材料。TPE-GRGRG的高纯度（98.60%）通过C18分析柱上的分析型HPLC进行了分析（图S1和表S1）。TPE-GRGRG的质谱图通过ESI-MS获得（图S2）。

细胞培养与生物成像

详细步骤

探针的AIE特性

通过改变水体积分数（f_w）从0%到100%，在DMSO/H₂O体系中评估了水体积分数对发射的影响，以测试TPE-GRGRG在固定发射波长440 nm下的AIE特性。如图1a所示，当水体积分数（f_w）低于80%时，TPE-GRGRG的荧光强度可以忽略不计。相反，当水体积分数超过80%后，荧光强度显著增强，在纯水中达到最大值

结论

本研究开发了一种基于聚集诱导发射（AIE）的肽基荧光探针TPE-GRGRG，用于在含有5% DMSO的10.0 mM HEPES（pH 7.4）缓冲系统中高效检测肝素。TPE-GRGRG在100%水中表现出特征性的AIE行为，显示出对肝素的高选择性、快速响应（< 30秒）、超高的灵敏度（LOD：0.30 nM）和较大的斯托克斯位移（132 nm）。机制研究表明TPE-GRGRG与肝素形成纳米聚集体

利益冲突声明

作者声明与本研究无关的任何财务或个人利益。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：22206154）和四川省化学合成与污染控制重点实验室项目资金（编号：CSPC202401）的支持。