《ChemistryOpen》：The Effect of Silk Fibroin Additive on the Properties of Tannic Acid-Based Bioadhesives
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本综述系统性探讨了添加不同浓度丝素蛋白（SF）对聚乙二醇/单宁酸/明胶（PEG/TA/明胶）组织粘合剂各项性能的优化作用。研究通过FTIR、SEM、粘附强度测试、溶胀降解分析、细胞毒性及抗菌实验等多种手段，证实SF的引入可显著提升粘合剂的机械强度、调控其溶胀与降解行为，并维持其良好的生物相容性与抗菌活性。这项工作为开发兼具优异机械性能和生物学功能的新型生物医用粘合剂提供了有价值的策略。
引言
组织粘合剂作为生物医学工程和外科应用领域的一项变革性进展，为传统的缝合与钉合技术提供了可行的替代方案。它们能够快速粘合组织并同时促进伤口愈合，在伤口闭合、手术介入和组织工程等多样化临床场景中展现出显著优势。基于生物聚合物的组织粘合剂因其固有的生物相容性、可生物降解性和良好的机械性能而受到日益广泛的关注。其中，聚乙二醇（PEG）基水凝胶已被广泛用作硬脑膜密封剂，但其机械强度不足往往限制了其完全取代缝线的能力。天然多酚化合物单宁酸（TA）因其优异的粘附性能和抗氧化特性，在组织粘合剂中作为功能组分被深入研究。为了优化TA基粘合剂的性能，各种添加剂被不断探索。天然生物材料如丝素蛋白（SF）展现出巨大的应用潜力。SF来源于家蚕，富含胺基、羧基、醇基和硫醇等多种官能团，有利于形成多种分子间相互作用，是水凝胶基粘合剂的有力候选材料。近年来，SF-TA混合粘合剂的研究方兴未艾，两者之间通过氢键、疏水相互作用、静电力和范德华力驱动的强亲和力，能够原位形成粘附性水凝胶。本研究旨在通过简单的制备方法合成SF，并利用多巴胺盐酸盐（Dopa）对其功能化，随后以两种不同的重量比将其掺入PEG/明胶/TA粘合剂水凝胶中，系统研究SF添加剂对水凝胶形貌、细胞毒性、溶胀行为、降解特性、流变学特征、粘附强度和抗菌活性的影响，以评估其生物医学应用潜力。
材料与方法
研究使用的材料包括聚乙二醇（PEG，分子量20 kDa）、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、单宁酸（TA）、来自猪皮的明胶（A型）、溴化锂（LiBr）、多巴胺盐酸盐（Dopa）和噻唑蓝（MTT）等，均购自Sigma–Aldrich公司。胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素则来自Gibco公司。
粘合剂的合成主要包括SF的提取与功能化以及组织粘合剂水凝胶的制备两个核心步骤。首先，通过将生丝在碳酸钠（Na2CO3）溶液中煮沸去除丝胶蛋白进行脱胶，所得纤维用蒸馏水彻底清洗后，溶解于9.3 M的溴化锂（LiBr）溶液中，随后进行透析、离心、储存和冷冻干燥以获得SF粉末。为增强粘附性能，利用EDC和NHS通过碳二亚胺化学将Dopa缀合到SF上。其次，通过一个略有变化的已报道程序氧化TA，将其溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠调节pH至9-10，再加入过氧化氢水溶液，在60°C下反应30分钟，中和后冷冻干燥获得氧化TA粉末。将一定量的明胶（按重量计10%）加入氧化TA中，随后按TA/PEG比例为3:1加入PEG。最后，将指定比例的多巴胺改性SF组合物加入上述溶液，充分混合后在冰箱中静置24小时，离心后获得黑色粘性水凝胶，并使用乙醇和紫外线进行灭菌。
对合成的粘合剂进行了全面的表征。结构分析采用傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪，扫描范围为500–4000 cm?1，并利用紫外-可见光谱（UV–vis）技术研究了多巴胺与SF的缀合情况。形貌分析则通过扫描电子显微镜（SEM）观察冷冻干燥后的SF粉末及粘合剂样品（含与不含SF）。机械测试方面，使用万能试验机根据标准（ASTM F2255?2015）评估粘合剂对牛皮的粘附强度，并通过搭接剪切试验获得剪切强度，同时使用旋转流变仪分析水凝胶的流变学特性。溶胀和降解分析通过将干燥样品浸入水中监测溶胀比，以及在PBS中连续摇动下测量重量损失百分比来进行。
体外分析包括细胞毒性试验、DAPI染色试验和微生物分析。细胞毒性通过MTT法评估人角膜上皮细胞的活力与增殖情况。DAPI染色用于在荧光显微镜下观察细胞浸润情况。抗菌活性则采用平板扩散法评估粘合剂对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果。
结果与讨论
扫描电子显微镜图像显示，SF颗粒呈现出高度均匀性，平均粒径约为2 μm，证实了提取方法的有效性。不含添加剂的PEG/TA/明胶样品显示出明确的多孔结构，且孔道相互连接。添加SF后，结构形貌与PTG样品相比未发生显著改变，图中箭头指示了SF粉末在基质中的均匀分布。
傅里叶变换红外光谱证实了SF在粘合剂基质中的存在。酰胺I带峰位于1652 cm?1，酰胺II带峰位于1531 cm?1，酰胺III带峰位于1232 cm?1，这些均表明了蛋白质结构的存在。SF-Dopa光谱在875和813 cm?1处显示出峰，分别对应邻苯二酚基团和多巴胺官能团。在PEG/TA/明胶配方中，C–H伸缩带从2880移至3000 cm?1，且C–N/C=O伸缩带减弱，表明TA与明胶的–NH2基团之间形成了共价键。O–H伸缩强度的降低则提示了TA、明胶、PEG和SF之间的相互作用。紫外-可见光谱分析显示，与SF相比，SF-Dopa样品在231和282 nm波长附近的吸收增强，证明了多巴胺的成功接入，且在395 nm附近没有吸收峰，表明反应过程中儿茶酚基团未被氧化为醌类。所有这些变化均表明多巴胺已成功与SF缀合。
粘附强度测试表明，PTG样品可在100 g重物下保持粘附稳定性5秒。SF的加入显著增强了粘附力，PTGS8样品可承受两个100 g重物达15秒，而PTGS2样品在10秒后失效。搭接剪切试验结果显示，PTGS8的粘附强度最高达到约420 kPa，PTGS2约为360 kPa，这均是不含添加剂样品（160 kPa）的两倍以上。流变学分析揭示了添加SF后粘度、弹性模量和粘性模量的显著差异。对照样品的粘性模量和弹性模量在10 Hz时约为100 Pa，复数粘度约为10 Pa·s。添加SF后，所有三个参数均显著增加，PTGS8在10 Hz时显示出6 × 105Pa的弹性模量和4 × 105Pa的粘性模量，复数粘度增加至约4 × 104Pa·s，表明分子内相互作用的形成和物理截留效应限制了聚合物链的运动。
溶胀研究表明，PEG/TA样品在168小时后溶胀率为85%。添加明胶后，由于明胶的亲水性，溶胀率增至90%。然而，SF的加入降低了溶胀，PTGS2和PTGS8的溶胀率分别为87%和77%。降解分析显示，PEG/TA/明胶样品在10天内完全降解。SF的加入降低了降解速率，PTGS2和PTGS8在10天后分别显示出82%和61%的降解。这些结果表明SF增强了粘合剂配方结构的完整性和稳定性。
细胞活力分析表明，含有SF的样品支持细胞增殖，其效果与对照组相当。然而，缺乏明胶且与TA交联的样品显示出轻微的细胞毒性，这可能源于TA的释放。这种效应通过添加明胶和SF得以缓解，突显了它们在增强生物相容性方面的作用。DAPI染色显示，PTG样品中细胞核染色良好，而PTGS2和PTGS8样品中可见细胞较少，这可能是由于交联度增加导致孔隙率降低，从而限制了细胞渗透。抗菌测试显示，针对不同细菌菌株存在明显的抑菌圈。PTG和PTGS8样品对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈约为15 mm，证实了中等的抗菌活性。然而，所有配方对大肠杆菌均未表现出抗菌活性。这些结果表明，该粘合剂对革兰氏阳性菌尤其有效。
聚乙二醇基粘合剂因其优异的粘附性能和相对较低的毒性，在工业和消费品中广泛应用。组织伤口对全球医疗系统构成重大挑战。传统的伤口闭合方法如缝合和钉合存在局限性，包括伤口覆盖不足、液体渗漏和感染风险增加。因此，迫切需要适用于不同伤口条件的更有效解决方案。粘附性水凝胶为伤口护理提供了一种有前景的替代方案，它们能够提供牢固的密封而不渗漏，易于应用，并提供机械支撑和灵活性。然而，其体内耐久性常因过度溶胀和不可预测的降解而受到阻碍，限制了实际应用。虽然聚乙二醇基组织粘合剂已广泛应用于外科手术，但其较弱的机械强度阻碍了其完全取代缝线。由TA、PEG和明胶组成的三元复合凝聚层作为一种新型生物粘合剂被提出，通过简单的物理共混方法制备。通过编程交联网络和调整与组织的界面相互作用，增强了TPG的粘附能力。优化的配方，特别是掺入10%（质量比）明胶的TPG10，在pH 6和37°C下固化24小时后，其粘附强度是TPG0（不含明胶）的三倍以上。增强的粘附机制涉及TA提供强大的界面粘附力，TA-明胶共价交联改善机械完整性，以及TA和PEG之间的动态氢键在变形时耗散能量。此外，TPG10还表现出抗菌活性、生物相容性和合适的降解特性，在大鼠皮肤伤口模型中证明了其在伤口闭合和组织修复方面的功效。Jing等人报道了由SF和TA合成生物功能水凝胶。由于TA的自组装特性及其与SF的良好分子相互作用，该配方产生了一种具有快速凝胶化、良好粘附性、剪切稀化和自恢复特性的混合水凝胶。在另一项研究中，SF通过一步交联过程功能化多巴胺以增强其粘附强度。掺入PEG以优化凝胶时间，产生了NESFB-Dopa，这是一种在干燥和潮湿条件下均具有优于临床使用的纤维蛋白密封剂粘附强度的生物粘合剂。在本研究中，开发了一种类似于Li等人的由TA、PEG和明胶组成的粘合剂，并添加了多巴胺改性SF以增强生物粘附性能。目标是提高粘附强度并缩短固化时间，同时保持生物相容性和抗菌性能。SF-Dopa模拟了贻贝粘附蛋白，在潮湿环境中提供优异的细胞粘附性和高生物相容性，尽管其机械强度低于合成生物粘合剂。我们的研究结果表明，SF显著增加了粘附力和流变学性能，同时降低了溶胀和降解速率。这些效应可归因于SF颗粒对聚合物链的物理截留以及SF相对于明胶更低的亲水性。TA在抑制细菌生长和生物膜形成方面发挥着至关重要的作用，这是伤口愈合和外科应用中的一个关键问题。其破坏细菌膜和抑制胞外聚合物产生的能力凸显了其在组织粘合剂中的抗菌潜力。这种抗菌活性增强了TA基粘合剂的安全性，并通过最大限度地降低感染风险来改善伤口愈合结果。Jing等人通过琼脂扩散试验证明了SF-TA凝胶对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌活性。SF-TA凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为9 mm和17 mm，表明其具有固有的细菌膜裂解特性。此外，Egan等人报告称，SF溶液具有固有的抗菌作用，浓度≥4% w/v时可灭活金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。然而，他们的研究结果也表明，虽然SF溶液在储存过程中能抑制细菌存活，但在存在营养物质的情况下，其在模拟感染伤口中的功效会减弱，因此需要对最终产品进行终端灭菌。我们的研究表明，由于凝聚层中存在TA，TPGS粘合剂对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌表现出强大的抗菌性能。所有样品对这些细菌均显示出清晰的抑菌圈，而对大肠杆菌则未观察到抑制作用。这种选择性的抗菌活性与之前关于含TA配方的报道一致。重要的是，SF的加入改善了组织粘合剂的物理和机械性能，且未损害其抗菌功效，保持了与不含添加剂的对照样品相同水平的活性。这些发现凸显了SF增强型组织粘合剂作为兼具优异粘附性、耐久性和抗菌性能的多功能生物粘合剂的潜力。
结论
生物粘合剂在外科手术的止血、组织密封和伤口愈合中起着至关重要的作用。然而，许多现有的生物粘合剂面临着在潮湿环境下粘附力弱、密封不充分以及凝血性能欠佳等挑战。本研究通过综合分析评估了SF作为添加剂在聚乙二醇基粘合剂中的作用。研究结果表明，SF增强了关键性能，特别是粘附强度，同时还调节了溶胀和降解速率，且并未损害粘合剂的抗菌功效。总体而言，掺入SF为提高生物粘合剂性能提供了一种有前景的策略，扩展了其在伤口愈合、出血控制和其他生物医学领域的潜在应用。
