基于F420自发荧光光谱流式细胞术的瘤胃产甲烷菌检测与定量研究

《Applied and Environmental Microbiology》：Detection and quantification of rumen methanogens using F420 autofluorescence profiling with spectral flow cytometry

本文开发了一种基于F420自发荧光的光谱流式细胞术（Spectral Flow Cytometry）方法，可在复杂瘤胃环境中直接、快速定量产甲烷菌（Methanogens）。该方法利用光谱解混（Spectral Unmixing）技术有效区分产甲烷菌与植物源性自发荧光颗粒，定量范围达4×104-4×107cells/mL，为反刍动物甲烷减排策略（如抑制剂、疫苗评估）提供了高效工具。

　　

ABSTRACT

瘤胃中的产甲烷古菌（Methanogenic Archaea）贡献了全球16%的甲烷排放。本研究针对瘤胃中占主导的F₄₂₀辅因子自发荧光产甲烷菌（主要为Methanobacteriales目），开发了一种光谱流式细胞术定量方法。瘤胃样本中的植物颗粒与产甲烷菌的自发荧光信号存在重叠，但通过光谱解混技术可有效区分二者。该方法在缓冲液培养的产甲烷菌和天然瘤胃样本中均实现了4×10⁴至4×10⁷cells/mL的定量范围。通过钠硼氢（NaBH₄）处理验证了F₄₂₀荧光特异性，并在施用甲烷抑制剂的牛、羊瘤胃样本中证实了产甲烷菌数量与甲烷产量的负相关性。此外，样本在4°C下储存3天仍适用于检测，表明方法具有良好的实用性。

INTRODUCTION

产甲烷菌利用瘤胃发酵产生的氢气、甲酸等底物生成甲烷，导致反刍动物能量损失和温室气体排放。现有定量方法如荧光显微镜、荧光原位杂交（FISH）和定量PCR（qPCR）存在操作繁琐、通量低等局限。尽管传统流式细胞术曾利用F₄₂₀荧光（激发峰420 nm）检测产甲烷菌，但瘤胃中植物材料的自发荧光干扰严重。光谱流式细胞术通过全光谱采集和解混算法，可区分重叠荧光信号，为本研究提供了技术基础。

MATERIALS AND METHODS

研究使用了7种瘤胃产甲烷菌分离株（如Methanobrevibacter ruminantium M1）和6种非产甲烷细菌作为对照。通过给牛（n=23）和羊（n=10）投喂甲烷抑制剂，收集瘤胃样本并同步测定甲烷排放量。样本经100 μm滤网过滤、PBS稀释后，使用Cytek Aurora光谱流式细胞仪（配置405 nm、488 nm、640 nm激光）分析。以NaBH₄处理验证F₄₂₀荧光特异性，并通过SYTO9/PI染色评估细胞膜完整性。qPCR（引物Ar915af/Ar1386R）和显微镜计数用于方法验证。

RESULTS

独特F₄₂₀信号区分瘤胃产甲烷菌与其他颗粒

培养的Methanobacteriales产甲烷菌在显微镜下呈现蓝色自发荧光（图1A），而瘤胃样本中可见类似荧光的微小颗粒与绿色/红色植物材料共存（图1B）。流式细胞术显示，产甲烷菌在V4探测器（473/15 nm波段）中形成均匀群体，侧向散射（SSC）信号较低（图2B）。瘤胃样本中部分V4阳性颗粒具有高SSC，经光谱分析发现其荧光谱与植物材料高度相似（图3E），而产甲烷菌的荧光谱与之显著不同（图3D）。通过光谱解混，以“All V12 bright”颗粒作为瘤胃背景参照，成功分离出产甲烷菌特异性信号（图3F-G），信噪比显著提升（图3I）。

荧光菌群验证

NaBH₄处理使产甲烷菌分离株（如M1）的V4阳性颗粒比例从87.9%-99.3%降至0.1%-5.2%（图4），瘤胃样本中从5.1%降至0.1%，且不影响细胞膜完整性。非产甲烷菌（如Methanomassiliicoccales ISO4-G1）和细菌对照均未检测到F₄₂₀荧光（图5），证实方法特异性。

定量性能与样本稳定性

对M1菌的系列稀释显示，光谱流式细胞术在4.05×10⁴cells/mL以上浓度时计数误差<5%（图6C）。瘤胃样本定量范围达10³-10⁸cells/mL（图6D）。未固定样本在4°C储存3天后，培养产甲烷菌计数下降40%，而瘤胃样本仅下降13%（图7），表明天然菌群更稳定。

抑制剂效果验证

在甲烷完全抑制的牛、羊瘤胃样本中，产甲烷菌计数低至9.95×10⁵cells/mL，而未处理组高达5.38×10⁸cells/mL（图8A、9A），与qPCR结果一致（图8B、9B）。混合不同抑制程度的瘤胃样本后，产甲烷菌计数呈线性变化（图10），进一步验证定量可靠性。

DISCUSSION

本研究首次将光谱流式细胞术应用于瘤胃产甲烷菌定量，解决了植物荧光干扰的难题。方法仅需微量样本，无需染色或DNA提取，适用于甲烷减排技术（如抑制剂、疫苗）的快速评估。局限性在于无法检测非荧光性Methanomassiliicoccales菌（占瘤胃产甲烷菌约15%），且紧密附着于protozoa或大颗粒的产甲烷菌可能被低估。未来可结合抗体标记或FISH探针，拓展至菌群互作研究。

结论

光谱流式细胞术凭借F₄₂₀自发荧光特性和光谱解混优势，为反刍动物甲烷减排研究提供了高效、可靠的产甲烷菌定量工具。