《Applied and Environmental Microbiology》：Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for enhanced 5-aminolevulinic acid production via precise porphobilinogen synthase activity modulation
ABSTRACT
5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是制药和农业领域的一种重要前体，但其微生物生产受到与必需血红素生物合成紧密耦合的限制。本研究针对谷氨酸棒杆菌中的卟胆原合酶（PBGS，由hemB编码）引入了一种系统的、活性分级的调控策略，以解耦5-ALA合成与血红素代谢。在结构和功能分析的指导下，构建了活性逐渐降低的PBGS变体，以研究酶活性、细胞生长和5-ALA积累之间的定量关系。对PBGS活性的受控减弱在维持基本代谢的同时，显著增强了5-ALA的积累并最大限度地减少了卟啉副产物。工程菌株FA3（hemB(D128E), hemA过表达）实现了生长和生产力的最佳平衡。代谢组学分析证实，PBGS的下调主要抑制了卟啉生物合成，而对中心碳代谢影响最小。随后的代谢和过程优化，包括gdhA和aceA的缺失、rhtA的动态表达和培养控制，进一步将摇瓶培养中的产量提升至14.44 g/L 5-ALA，这是我们所知的在类似条件下谷氨酸棒杆菌报道的最高摇瓶滴度。这项工作首次系统剖析了PBGS活性依赖的代谢调控，并证明了对必需酶的分级控制能够实现理性的代谢解耦，为有价值化合物的稳健、高产微生物生产提供了一个广泛适用的框架。
IMPORTANCE
5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是一种具有制药和农业应用的重要前体，但其微生物生产常常受到其与必需血红素代谢紧密联系的限制。本研究系统地调控了卟胆原合酶活性，以在维持细胞生长的同时，将5-ALA积累与过度的卟啉通量解耦。该策略不仅使谷氨酸棒杆菌的5-ALA滴度达到报道最高，而且突显了一个可广泛应用的框架，用于理性设计必需代谢酶以实现有价值化合物的稳健、高产微生物生产。
INTRODUCTION
5-ALA是卟啉化合物（包括血红素和叶绿素）的通用前体，在医学、农业和工业领域具有广泛应用。在自然界中，5-ALA通过C4和C5途径合成，这两种途径都与血红素生物合成紧密相连，并受到严格的反馈调节。由于这种耦合，5-ALA合成与必需血红素代谢的紧密联系对其微生物过量生产提出了挑战。近年来，通过代谢工程、动态调控和高通量筛选构建高产5-ALA菌株取得了显著进展。模型宿主如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌已被广泛工程化，采用的策略包括筛选高效的ALAS变体、途径优化、增强前体供应和提高菌株耐受性。为了进一步克服生产瓶颈，研究人员将系统代谢工程与进化方法相结合，例如构建突变体库并结合高通量筛选（HTS）。尽管取得了这些进展，但与工业氨基酸（如谷氨酸和赖氨酸）的生产相比，5-ALA的生物合成在生产率和产量方面仍然落后，这凸显了需要能够克服内在代谢限制的策略。
卟胆原合酶（PBGS，由hemB编码）是一种高度保守的金属酶，催化两个5-ALA分子缩合生成卟胆原（PBG），这是四吡咯生物合成的关键前体。PBGS被广泛认为是5-ALA过量生产的主要限速酶。下调PBGS活性是减少前体消耗和增强5-ALA积累的常用方法。反义RNA、CRISPRi介导的干扰、启动子替换以及引入ASV降解标签等策略已被采用。然而，这些方法常常面临限制，包括部分或不受控制的抑制、脱靶效应，或者缺乏对不同程度PBGS下调如何影响酶功能和细胞生理的定量理解。先前在大肠杆菌中的研究表明，严重的PBGS损伤会导致生长停滞，而保留低残余活性（约10%）的突变体仅在外源补充5-ALA时才能存活，这凸显了降低PBGS活性与维持细胞活力之间的内在权衡。
在本研究中，基于我们对谷氨酸棒杆菌PBGS的结构和功能分析，我们构建了一组跨越三个不同活性水平（中等、低和极低）的突变体。系统评估了它们对细胞生理、生化特性和代谢网络的影响，从而确定了一个结合了稳健生长和高5-ALA生产力的最佳变体。为了进一步优化碳通量，我们依次删除了gdhA（谷氨酸脱氢酶，以减少向非目标代谢物的分流）和aceA（异柠檬酸裂解酶，以最大限度地减少乙醛酸循环和三羧酸（TCA）循环之间的竞争）。作为这些策略的补充，选择了一个具有动态调控能力的启动子来驱动外排转运蛋白的表达，从而进一步促进5-ALA积累。在摇瓶培养中，工程菌株实现了14.44 g/L的5-ALA滴度，为谷氨酸棒杆菌在类似条件下创造了新纪录。据我们所知，这是首次系统分析PBGS活性变体并将其应用于构建高产ALA菌株的研究。这些结果共同突显了一种合理的策略，即适度减少血红素生物合成，同时有效增加吡咯中间体的积累。
MATERIALS AND METHODS
Strains and plasmid construction
本研究涉及的所有菌株、质粒和引物列于表1和表2以及表S1。pK18ΔgdhA和pK18ΔaceA分别通过将谷氨酸棒杆菌的谷氨酸脱氢酶基因gdhA和异柠檬酸裂解酶基因aceA的上游和下游片段插入pK18mobSacB中获得，目的是删除这些基因。表达质粒pXMJ19hemA携带来自荚膜红杆菌ATCC 11166的hemA基因。通过分子操作构建了包含不同hemB突变（S288A, D128E, R231K）的质粒以及包含动态启动子Pcyd驱动rhtA或sfGFP表达的质粒。通过电穿孔法将质粒转入谷氨酸棒杆菌F343，经过筛选和测序验证，获得了一系列工程菌株（F2-F8, FA1-FA8）。
Growth conditions and shake flask cultivation
大肠杆菌DH5α在LB培养基中好氧培养。谷氨酸棒杆菌使用BHI培养基进行培养和转化。对于5-ALA生产，将单菌落接种于种子培养基中，过夜培养后转接至CGXII培养基中。培养一定时间后加入IPTG诱导基因表达，并补充甘氨酸。发酵过程中使用氨水维持pH。定期取样分析细胞生长和葡萄糖消耗。
Molecular docking and dynamics simulation
使用同源建模获得PBGS的三维结构，从PubChem数据库获取5-ALA配体结构。使用AutoDock Vina进行分子对接，确定结合位点。使用GROMACS软件包进行100 ns的分子动力学（MD）模拟，以验证对接结果的可靠性。轨迹分析包括均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）、回转半径（Rg）、溶剂可及表面积（SASA）和氢键分析。
Enzyme activity and kinetic parameter determination
按照报道的方法进行谷氨酸棒杆菌hemB基因（cghemB）及其突变体的表达、纯化和活性测定。在特定反应条件下测量动力学参数，使用GraphPad Prism软件通过非线性回归计算Km和Vmax。
Stability assessment during serial passage
为了评估遗传稳定性，将菌株FA1和FA3在CGXII培养基中连续传代10代。比较第1代和第10代的生物量（OD600）和5-ALA产量，若差异小于5%，则认为表型稳定。
Characterization of the Pcydpromoter
将携带由Pcyd启动子控制的sfGFP报告基因的质粒导入谷氨酸棒杆菌F343。将阳性克隆接种于含有不同浓度血红素（0.05–20 mg/L）的培养基中培养，使用荧光分光光度计测量绿色荧光强度。
Metabolomics analysis
对对照菌株F343-hemA（CK）和工程菌株FA3（T）进行代谢组学分析。发酵液冻干后，用甲醇溶液提取代谢物。使用超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）系统进行分析。数据经过峰值检测、校正、对齐，并使用数据库进行代谢物鉴定。进行多变量统计分析以识别差异代谢物。
Analytical methods
使用紫外分光光度计在600 nm处测量细胞生物量（OD600）。使用生物传感器测定葡萄糖和乳酸浓度。使用Ehrlich试剂法测定5-ALA和PBG浓度。使用荧光法测定血红素浓度。
Statistical analysis
所有实验均进行三次重复。数据表示为平均值±标准差（SD）。使用GraphPad Prism软件进行统计分析。
RESULTS AND DISCUSSION
Enzymatic characterization and structural-dynamic analysis of PBGS mutants
与野生型（WT）PBGS相比，S288A和D128E突变体的酶活性分别降至15.5%和5.17%，而R231K仅保留痕量活性。动力学分析显示，WT、S288A和D128E的Vmax值分别为71.33、13.07和4.262 μmol·h?1·mg?1，相应的Km值分别为0.252、0.4225和0.3876 mM。这些结果表明所有突变都显著降低了催化效率。
分子对接分析阐明了活性丧失的结构基础：在S288A中，羟基的缺失破坏了（α/β）8-桶状结构，但不干扰Zn2+结合；在D128E中，重新定位的羧基削弱了关键的极性相互作用，可能影响了Zn2+配位微环境；在R231K中，缺失的亚氨基基团破坏了关键的极性接触。结合能计算显示底物亲和力降低。
蛋白质结构稳定性使用RMSD、RMSF和Rg进行评估。所有系统在50 ns后达到平衡，WT表现出最低的平均RMSD，S288A、D128E和R231K的RMSD值逐步升高，表明刚性逐步降低。RMSF和Rg分析显示，R231K表现出显著增加的灵活性和构象动力学，而S288A和D128E仅显示中等的局部波动。类似地，R231K显示出最高的SASA和最大的波动，反映了疏水核心的显著暴露。
氢键分析表明，键数减少和波动增加会损害酶-底物稳定性。在突变体中，D128E形成更少且不稳定的氢键，而R231K表现出过度的波动，破坏了氢键网络。
总之，这些分析阐明了PBGS突变体的结构-功能关系。S288A、D128E和R231K都扰动了催化中心，其中R231K引起最严重的结构畸变。虽然S288A和D128E对整体构象影响相对有限，但D128E引起更明显的局部波动和氢键丢失。这些发现为关键残基在PBGS催化中的机制作用提供了原子水平的见解，并为理性酶设计和工程提供了理论基础。
Construction of PBGS activity-reduced mutants and their physiological impacts
PBGS是将5-ALA引导进入血红素生物合成途径的唯一酶。基于三个关键突变（A288、E128和K231）的半理性工程，我们通过基因替换构建了相应的谷氨酸棒杆菌突变株F2、F3和F4。酶活测定表明，尽管野生型菌株中的PBGS活性相对较低，但所有突变株均表现出逐步降低的活性，进一步证实这些突变损害了PBGS的催化功能。在CGXII培养基中的生长测定显示，任何菌株均未出现显著的延滞期。F1–F3在1至12小时之间呈现对数生长，而F4延长至16小时。最终的OD600值分别为0.98、0.93、0.91和0.88。突变体的葡萄糖消耗速率在早期较慢，但所有菌株最终消耗约10 g/L葡萄糖。菌落形态显示F2和F3与F1相似，而F4菌落明显更小。
这些结果表明，定点诱变能够实现PBGS活性的分级降低，并对宿主生长和代谢产生相应影响。观察到PBGS活性与生长之间存在正相关关系；然而，即使在F4中活性降低超过99%，仍然允许近乎正常的生长，这表明最低限度的PBGS活性足以维持必需的血红素生物合成。这与早期的发现形成对比，早期的研究发现PBGS缺失突变体即使在外源补充5-ALA的情况下也表现出严重缺陷。与转录调控方法（如RNAi或CRISPRi）相比，直接的酶突变提供了稳定的、序列固有的控制，无需额外的调控元件，提供了一种广泛适用的策略。
Impact of PBGS attenuation on 5-ALA accumulation and heme biosynthesis
为了评估弱化PBGS对5-ALA生产的影响，将携带hemA的质粒导入菌株F1–F4，得到FA1–FA4。亲本野生型菌株F343（菌株F1）的5-ALA和血红素水平均可忽略不计，证实5-ALA生产在很大程度上依赖于hemA过表达和PBGS调控。诱导48小时后，5-ALA滴度分别达到2.32、3.43、4.22和3.61 g/L。所有PBGS突变体均显示5-ALA积累显著增加，其中FA3改善幅度最大（1.82倍）。生物量分析表明OD600值分别为23.71、22.66、22.05和20.07，仅FA4显示出显著降低。
发酵液颜色变化显著：FA1呈深红棕色，FA2和FA3逐渐变浅，FA4呈淡黄色。这与由于PBGS活性降低导致的卟啉积累减少相关。途径中间体的定量分析证实，与FA1相比，FA2–FA4中的PBG水平分别降低了94.2%、96.3%和98.7%。血红素水平从FA1的17.29 mg/L降至FA2–FA4的15.15、6.42和4.46 mg/L，表明下游生物合成受到显著抑制。乳酸副产物的积累也显著减少，从FA1的7.40 g/L降至2.08、1.32和1.53 g/L，可能反映了突变体中呼吸通量增强和溢出代谢减少。
先前的研究通过抑制hemB表达或促进PBGS降解来提高5-ALA产量，取得了适度的改善（0.86–3.68 g/L）。然而，缺乏对PBGS活性水平的系统定量评估。本研究中，定点诱变有效地将碳通量从血红素生物合成转移开，降低了卟啉积累，增强了5-ALA生产，同时最小化了生长缺陷。值得注意的是，FA3在接近野生型生物量生长水平的条件下实现了最高的5-ALA产量，超过了先前报道的菌株。此外，FA3在连续传代过程中表现出强大的遗传稳定性。相对于第一代，第十代的生物量变化仅为2.1%，5-ALA产量变异为3.45%，均低于5%，表明其生产性状在整个传代过程中保持稳定。与早期仅保留约10%活性但遭受显著生长损害的PBGS突变体不同，FA4尽管酶活性极低，仍保持了有限的生长和产物形成，其比产量仅略低于FA3。这一观察进一步凸显了谷氨酸棒杆菌显著的代谢鲁棒性。
总之，这些发现揭示了PBGS活性与宿主代谢之间的直接关系，并证明精确的突变调谐能够实现对必需酶的精细控制。FA3在生长、底物利用、5-ALA积累和减少副产物形成之间取得了最佳平衡，被选作进一步工程化的底盘菌株。本研究首次将PBGS活性降至迄今为止报道的最低水平，有效阻止了通量过度流向血红素和卟啉副产物，同时实现了5-ALA积累的最大化改善。这不仅有利于下游纯化，而且为血红素生物合成的精细调控和5-ALA的高效生产提供了新的见解和参考。
Metabolomic insights into the impact of PBGS attenuation
为了研究PBGS活性降低的代谢后果，对对照菌株FA1（CK组）和PBGS突变株FA3（T组）进行了代谢组学分析。重要的是，两个菌株具有相同的hemA过表达背景，主要区别在于FA3中PBGS活性的降低。根据VIP >1和P <0.05的标准，共鉴定出1156种差异代谢物，包括622种下调和534种上调的化合物。尽管差异代谢物涵盖多个化学类别，但通路水平分析为PBGS减弱引发的代谢适应提供了更具生物学意义的解释。
KEGG富集分析突出显示了几条具有显著响应的通路，特别是辅因子生物合成、核苷酸代谢和特定的氨基酸相关过程。将关键代谢物映射到代谢网络显示，PBGS的直接产物PBG降低了0.792倍，同时粪卟啉I和III显著减少。由于粪卟啉III是粪卟啉原III的氧化形式——粪卟啉原III是原卟啉IX和血红素的直接前体，这些协调的下降表明卟啉途径存在明显的瓶颈，支持PBGS减弱（而非hemA过表达）是驱动这些变化的主要因素。
除了这一主要效应外，几个次级通路水平的调整表明了对部分减少的血红素可用性的补偿性响应。核黄素水平增加了1.55倍，这与FMN/FAD合成增强一致，当血红素依赖性细胞色素受限时，这种转变可能有助于稳定电子传递能力。类似地，四氢叶酸和二氢叶酸的增加表明一碳代谢增强，这支持氧化还原平衡并为核苷酸生物合成提供前体。嘌呤和嘧啶途径也显示中间体升高——包括肌苷、次黄嘌呤、dTMP和乳清酸——暗示核苷酸生产得到加强。这种上调可能有助于在血红素基础的氧化磷酸化可能受限的情况下维持DNA复制、修复和ATP生成途径。尽管富集分析指向氨基酸代谢，但实际的代谢物变化很小，表明生理影响有限。
中心碳代谢基本保持稳定。糖酵解、磷酸戊糖途径、TCA循环和大多数氨基酸途径显示出最小的扰动，表明PBGS减弱并未广泛破坏细胞能量或碳通量。相反，细胞似乎通过调整辅因子和核苷酸的生物合成来特异性响应降低的卟啉通量，以保持电子流、生物合成能力和整体代谢鲁棒性。尽管存在上游抑制，代谢组学数据集显示相对稳定的细胞内血红素信号，表明稳态机制可能在功能范围内缓冲血红素水平。然而，我们承认代谢物池的变化本身不能明确确定通量改变，需要整合转录组学或同位素示踪的未来研究来验证这些通路水平的解释。
因此，在相同的hemA过表达背景下，hemB(D128E)主要通过限制碳通量进入下游消耗卟啉的步骤来提高5-ALA产量，而不是通过扰乱全局代谢。观察到的核黄素、一碳和核苷酸途径的调整可能代表了在PBGS活性降低情况下维持呼吸和生物合成功能的靶向补偿性适应。总之，这些发现表明，适度的PBGS下调可以有效地增强5-ALA积累，同时保持代谢稳态，为精细调控PBGS作为工程化高产5-ALA生产菌的策略提供了机制依据。
Blocking competing pathways to enhance 5-ALA synthesis
琥珀酰辅酶A是5-ALA的关键前体，主要通过TCA循环和乙醛酸循环供应。在TCA循环中，α-酮戊二酸（α-KG）可通过谷氨酸脱氢酶
