大豆根瘤定殖动态：不同生长阶段接种下慢生根瘤菌与中华根瘤菌的竞争格局

《Applied and Environmental Microbiology》：Soybean root nodule occupancy: competition between Bradyrhizobium and Sinorhizobium strains inoculated at different plant growth stages

本研究揭示大豆植株年龄是调控根瘤菌（Bradyrhizobium与Sinorhizobium）竞争性定殖的关键生态驱动因子。通过在三阶段（播种T0、萌发后2周T2、4周T4）接种不同比例菌株，发现早期接种偏好慢生根瘤菌（BR），而后期接种显著转向中华根瘤菌（SR）主导（T4时占比达88%–99%）。该发现为优化豆科植物-微生物互作策略提供了关键时序依据。

　　

摘要

大豆（Glycine max L.）作为全球重要豆科作物，其根瘤常由慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium, BR）和中华根瘤菌属（Sinorhizobium, SR）共同定殖。尽管土壤pH、宿主基因型等因素已知会影响根瘤菌选择，但宿主植株年龄对定殖偏好性的影响尚不明确。本研究通过在大豆三个生长阶段（播种时T₀、萌发后2周T₂、4周T₄）接种不同细胞密度的BR（Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110）和SR（Sinorhizobium fredii USDA 191）菌株，利用16S rRNA基因扩增子测序分析根瘤及根际样本。结果发现，播种期接种时BR在根瘤中占主导地位，但随着接种时间推迟至T₂和T₄阶段，SR竞争力显著增强，尤其在T₄时SR在所有处理中占比达88%–99%。相反，收获期根际中两菌株序列数量相近。这表明宿主年龄是驱动根瘤菌竞争的关键因素，为优化大豆接种时机提供了新见解。

引言

大豆通过与其菌根瘤菌共生固氮满足大部分氮需求。目前已发现慢生根瘤菌属（BR）、中华根瘤菌属（SR）、根瘤菌属（Rhizobium）和中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）等四属根瘤菌可侵染大豆，其中BR和SR最具农业意义。BR菌株基因组较大（约9.1 Mb），倍增时间长达7–10小时；SR则基因组较小（约6.7 Mb），倍增时间仅1–2小时，但两者均能高效结瘤。既往研究多关注土壤pH、宿主基因型等对BR和SR竞争的影响，例如BR在酸性土壤中占优，SR偏好碱性环境。然而，关于宿主植株年龄如何调节根瘤菌选择的研究仍属空白。植物根系分泌物随生长阶段变化，从幼苗期的简单糖类逐渐转为成熟期的黄酮类、酚酸等次生代谢物，这种变化可能通过影响微生物群落结构间接调控根瘤菌竞争。本研究旨在明确大豆植株年龄对BR和SR菌株竞争结瘤的影响。

材料与方法

研究采用温室实验设计，以大豆品种Agate为材料，在灭菌砂培系统中培养。分别于播种时（T₀）、萌发后2周（T₂）和4周（T₄）接种BR与SR的单一或混合菌液（混合比例设为1:1、1:100、100:1）。收获时采集根瘤及根际样本，通过16S rRNA基因V3-V5区扩增子测序（Illumina NextSeq 2000平台）分析菌群组成，并结合结瘤数、植株生物量等生理指标评估接种效果。

结果与讨论

1. 1.
   单菌接种对照组的根瘤定殖特异性
   单菌接种实验证实BR和SR均能独立形成有效根瘤。BR接种组中BR序列占比超99.3%，SR接种组中SR序列占比达96.5%–99.9%，且各接种时间点结果一致。少量非接种菌序列（<1%）可能源于测序索引跳变或微量交叉污染，但不影响菌株定殖特异性的结论。
2. 2.
   混合接种中根瘤菌竞争的时序性转变
   混合接种结果显示，接种时间显著影响根瘤菌竞争优势：
   • •
     T₀期：BR在1:1比例下占据89%的根瘤序列，即使在1:100的SR优势接种比例下仍保有15%的定殖率，表明早期宿主环境更利于BR。
   • •
     T₂期：SR竞争力上升，1:1比例下SR序列占比升至93%，即便在100:1的BR优势比例下，SR仍能获得49%的定殖份额。
   • •
     T₄期：SR占据绝对优势，在1:1比例下占比97%，100:1比例下仍维持93%。
     对SR的16S rRNA基因拷贝数（每个基因组3个拷贝）进行标准化校正后，上述趋势依然成立。
3. 3.
   根际菌群与根瘤定殖的解耦现象
   根际样本中BR和SR序列总量仅占全部细菌序列的3.2%，且两菌株在根际的相对丰度无显著差异，与根瘤内定殖模式的剧烈变化形成对比。非根瘤菌属如芽孢杆菌属（Bacillus）在根际占主导（64%），但其分布与处理无关。多元分析（NMDS）表明接种比例和时间未显著改变根际菌群结构，进一步支持根瘤定殖由宿主选择性驱动而非根际菌群丰度。
4. 4.
   植株生长参数的稳定性
   尽管根瘤菌定殖模式变化显著，各处理间结瘤数、根冠生物量均无一致差异，说明BR与SR均能有效支持大豆生长，定殖偏好性未明显影响共生效能。

机制探讨

宿主年龄效应可能源于以下机制：

• •
  根系分泌物组分变化：大豆成熟期黄酮类和酚酸分泌量较幼苗期显著增加（4周时黄酮类提升36%，酚酸提升71%），这些化合物作为根瘤菌信号分子可能优先激活SR的结瘤基因。
• •
  菌株生理特性差异：BR的慢速生长特性更适应早期根际环境，而SR的快速增殖能力和代谢灵活性使其能高效利用成熟期复杂的根系分泌物。
• •
  宿主选择压力变化：幼苗期可能通过严格筛选保障初始结瘤效率，而成熟期因氮需求增加可能放宽选择标准。

总结

本研究首次系统揭示大豆植株年龄对根瘤菌竞争性定殖的调控作用：早期生长阶段（T₀）偏好慢生根瘤菌（BR），随植株成熟逐渐转向中华根瘤菌（SR）主导（T₄）。该发现深化了对植物-微生物互作时序性调控的理解，为通过优化接种时间提高豆科作物共生效率提供了理论依据。