通过抑制脂肪酸生物合成来提高异养性藻类Chromochloris zofingiensis的代谢可塑性，从而增强虾青素的产量

《Algal Research》：Metabolic plasticity through the inhibition of fatty acid biosynthesis enhances astaxanthin production in heterotrophic Chromochloris zofingiensis

研究异养条件下Chromochloris zofingiensis的脂肪酸合成抑制剂对生长及虾青素积累的影响，发现ce虏伦因通过代谢重编程（激活糖酵解、PPP、TCA循环及氮代谢）促进虾青素合成，其中丙酮酸、6-磷酸葡萄糖酸等关键代谢物起调控作用。

　　

刘明萌|高健|李志江|胡书芬|阮欣|周勇|陈巧红

湖北工程学院土木工程学院，中国孝感市，432000

摘要

Chromochloris zofingiensis在异养条件下能够达到极高的细胞密度，已成为生产虾青素的有希望的候选物种。虾青素主要与脂肪酸形成酯类，存在单酯和双酯两种形式。虾青素与脂肪酸之间的相互作用仍不甚明了。本研究探讨了cerulenin（C）、sethoxydim（S）和molinate（M）对微藻生长和虾青素积累的影响。虽然cerulenin显著增加了虾青素的含量，但sethoxydim和molinate的应用抑制了脂肪酸的生物合成，并同时抑制了异养C. zofingiensis中的虾青素生产。在氮充足的条件下（第4天），5 μM的cerulenin处理使生物量产量达到13.6 g·L^?1，虾青素含量比对照组增加了1.47倍。激活糖酵解、戊糖磷酸途径（PPP）、三羧酸（TCA）循环以及核苷酸和氨基酸代谢促进了cerulenin处理组中虾青素的积累。代谢网络分析确定丙酮酸（PA）、6-磷酸葡萄糖（6PG）、苹果酸（MA）、谷氨酸（Glu）和鸟氨酸（Orn）是关键的调节代谢物。同时，cerulenin通过上调phytoene合成酶（PSY）和β-类胡萝卜素酮酶（BKT）基因的表达促进了虾青素的积累。结果表明，抑制脂肪酸生物合成后虾青素积累的增加可能是由于代谢重编程，使碳流从脂质生物合成重新定向到虾青素生产。这项研究加深了我们对微藻代谢调控的理解，并为在异养条件下提高C. zofingiensis中虾青素的产量提供了实用策略。

引言

虾青素是一种高价值的酮类胡萝卜素，广泛存在于各种海洋生物和微生物中[1]。由于其优异的着色性能、强抗氧化活性和多种健康益处[2]、[3]，目前它在食品、饲料、制药和营养保健品领域得到广泛应用。人类无法自身合成虾青素，必须通过饮食摄入，主要来自食物链中的微藻、甲壳类动物和鲑鱼[4]。在天然生产者中，淡水微藻Haematococcus pluvialis被认为是最高效的天然生产者，目前是商业规模生产虾青素的主要生物[5]。然而，H. pluvialis存在一些缺点，包括生物量产量低、易受其他快速生长生物的污染，以及需要高强度光照来积累虾青素[6]。近年来，Chromochloris zofingiensis因其快速生长、能够达到高细胞密度、对不良环境条件的抵抗力以及在异养条件下积累虾青素的能力而成为生产虾青素的有希望的候选物种[7]。C. zofingiensis的细胞密度可超过200 g·L^?1 [8]，大约是H. pluvialis的30倍[1]。尽管如此，C. zofingiensis中虾青素的含量相对较低（干重的0.06%），这限制了其商业应用[9]。

阐明异养C. zofingiensis中虾青素生物合成的调控机制对于识别限制虾青素积累的关键代谢瓶颈以及开发提高虾青素产量的策略至关重要。在微藻中，β-胡萝卜素是虾青素的直接前体，经过连续的羟基化和酮化反应后主要与脂肪酸形成酯类[10]。这些虾青素酯主要沉积在脂质体（LBs）中，脂质体富含三酰甘油（TAG），作为专门的储存场所[11]。在H. pluvialis中，虾青素的积累与脂肪酸代谢密切相关，尤其是油酸[12]。当在H. pluvialis中使用脂肪酸生物合成抑制剂时，虾青素几乎被完全消除，同时脂肪酸和TAG也显著减少[13]。然而，需要注意的是，上述研究主要在自养条件下进行。C. zofingiensis的异养生长能力为探索异养条件下虾青素生物合成的未知机制提供了宝贵的机会。由于C. zofingiensis中的虾青素主要以脂肪酸酯的形式积累，因此了解脂肪酸代谢对于阐明异养生长过程中虾青素的合成和储存机制至关重要。因此，本研究的主要目的是阐明异养C. zofingiensis中脂肪酸与虾青素积累之间的关系。

Cerulenin、sethoxydim和molinate是知名的脂肪酸生物合成抑制剂，各自针对途径中的特定酶促步骤。Cerulenin通过靶向脂肪酸合成酶的酮酰-ACP合成酶（KS）结构域来抑制链延长所需的缩合过程[14]。Sethoxydim是乙酰-CoA羧化酶（ACCase）的特异性抑制剂，该酶负责催化脂肪酸生物合成的第一个关键步骤，即将乙酰-CoA转化为丙二酰-CoA[15]。Molinate抑制烯酰-ACP还原酶（ENR）的活性，该酶在脂肪酸链延长过程中负责还原双键[16]。先前的一项研究发现，添加10 μM的cerulenin会抑制Chlamydomonas reinhardtii的生长并阻断其脂肪酸生物合成[17]。当Vischeria Helvetica细胞在缺氮条件下培养7天并添加sethoxydim时，其类胡萝卜素含量高于未添加sethoxydim的细胞[16]。此外，Scenedesmus sp.在添加molinate后表现出更高的细胞玉米黄质含量（4.1 mg/g）[18]。然而，脂肪酸生物合成抑制剂在异养条件下如何影响C. zofingiensis的细胞生长和虾青素积累的机制仍有待阐明。

本研究旨在利用异养生长的C. zofingiensis进行天然虾青素的工业生产，并全面阐明脂肪酸生物合成抑制剂提高虾青素产量的机制。探讨了三种不同的脂肪酸生物合成抑制剂（cerulenin、sethoxydim和molinate）在异养条件下对C. zofingiensis生物量和虾青素积累的影响，发现cerulenin是最有效的代谢调节剂。使用广泛靶向的代谢组学方法，研究了在有无cerulenin的情况下与中心碳代谢、核苷酸代谢、氨基酸代谢和类胡萝卜素生物合成相关的关键代谢物的变化。关键基因的表达揭示了cerulenin如何影响虾青素的生物合成。本研究为提高异养C. zofingiensis中虾青素的商业生产提供了重要的机制见解和实用应用。

微藻菌株和生长条件

绿色淡水微藻Chromochloris zofingiensis（ATCC 30412）来自美国类型培养物收藏中心（ATCC，马里兰州罗克维尔）。使用改良的Endo培养基支持C. zofingiensis的异养培养[19]。培养基的pH值使用3 M NaOH调整至pH 6.5后进行灭菌。一个C. zofingiensis菌落在50 mL灭菌后的改良Endo培养基中，在100 mL Erlenmeyer烧瓶中于26°C下培养7天，同时进行轨道运动

脂肪酸抑制对生物量和虾青素积累的影响

本研究调查了cerulenin（C）、sethoxydim（S）和molinate（M）在异养条件下对微藻生长和虾青素积累的影响（图1）。添加cerulenin后，第4天的生物量积累分别达到了6.7 g·L^?1和13.6 g·L^?1的最高产量，分别比对照组高出8%和3%（图1A-B）。相反，sethoxydim和molinate对

结论

本研究显示，cerulenin显著增加了C. zofingiensis的生物量和虾青素产量。sethoxydim和molinate的利用减少了脂肪酸的生物合成并抑制了虾青素的产生。代谢组学分析表明，cerulenin加速了葡萄糖的利用，促进了丙酮酸的积累，为TCA循环提供了更多的乙酰-CoA，并产生了额外的ATP以支持虾青素的合成。cerulenin还激活了PPP途径，提高了NADPH的产量

CRediT作者贡献声明

刘明萌：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，研究，资金获取，数据管理。高健：方法学，研究，资金获取，正式分析。李志江：方法学，研究，资金获取，正式分析。胡书芬：验证，数据管理，概念构思。阮欣：验证，数据管理，概念构思。周勇：验证，数据管理，概念构思。陈巧红：撰写 – 审稿与编辑，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了湖北省科技学院河流与湖泊智能健康感知与生态恢复重点实验室（项目编号：HGKFYB05）、CPSF博士后奖学金计划（项目编号：GZC20232917）、孝感市自然科学基金（项目编号：XGKJ2023010066）和CRSRI开放研究计划（项目编号：CKWV2025949/KY）的支持。