基于GO-SELEX筛选的适配体的比色适配体传感器，用于检测鱼类和虾类中的诺氟沙星抗生素残留

《Analytica Chimica Acta》：Colorimetric Aptasensor Based on GO-SELEX Screened Aptamers for Detecting Norfloxacin Antibiotic Residues in Fish and Shrimp

诺氟沙星（NOR）aptamer通过GO-SELEX筛选获得，并构建了基于Fe3O4纳米颗粒的比色传感器，检测限1.04 ng/mL，线性范围1.56-100 ng/mL， shrimp和fish样本加标回收率89.33%-103.24%，与HPLC性能相当。

　　

王雪|周朝阳|姜双|孙琦|雷贤璐|谢勇|乐涛

中国重庆市重庆师范大学生命科学学院淡水鱼类保护与利用重点实验室，重庆，401331

摘要

诺氟沙星（NOR）因其强大的抗菌活性、广谱疗效和成本效益而在畜牧业和水产养殖中得到广泛应用。然而，不当使用可能对人类造成致畸和致癌风险，因此准确快速地检测食品中的NOR残留物至关重要。在本研究中，通过氧化石墨烯系统进化配体法（GO-SELEX）筛选出一种具有高亲和力（Kd = 84 nM）和高选择性的抗NOR适配体，并制备了一种比色适配体传感器。该适配体传感器的检测限为1.04 ng/mL，线性范围为1.56-100 ng/mL。在虾和鱼样品分析中，适配体的平均回收率在89.33%到103.24%之间，变异系数在3.63%到9.43%之间，表明其具有良好的分析精度和准确性。本研究构建的适配体与高效液相色谱（HPLC）在NOR检测方面表现出高度一致性，表明这是一种高效且有前景的可持续监测方法。

引言

诺氟沙星（NOR）是一种第三代氟喹诺酮类抗生素，由于其强大的抗菌活性、广谱疗效和低成本，在畜牧业和水产养殖中得到广泛应用[1]。然而，不当使用会导致其在动物制品和环境中的积累。一旦通过食物链进入人体，它可能在体内生物累积，引发消化系统不良反应、神经系统损伤和心血管异常，并具有潜在的致畸和致癌风险[2]。美国食品药品监督管理局、欧盟和中国农业部已制定了NOR的最大残留限量[3][4]。此外，中国已宣布禁止在食用动物中使用包括诺氟沙星在内的四种兽药，并撤销了相关兽药产品的批准文号[5]。因此，迫切需要开发高灵敏度和可靠的分析方法来有效监测NOR残留物，确保环境安全并保护公众健康。目前已开发出多种方法用于检测动物源性食品中的NOR残留物，包括微生物抑制[6]、毛细管电泳[7]、荧光光谱法[8][9]、高效液相色谱[10]、液相色谱-质谱[11]、超高效液相色谱以及基于免疫的分析方法[12]。尽管这些方法已被证明是实用且广泛应用的技术，但它们仍存在一些局限性，如样品预处理复杂、需要专业培训的人员、高成本的仪器设备以及需要动物模型。因此，开发一种快速有效的NOR检测分析技术尤为重要。

适配体是一类新发现的单链寡核苷酸，通过体外筛选产生，可作为分子识别元件，通过SELEX与目标分子实现高特异性和高亲和力结合[13]。适配体作为分析农用化学品、抗菌剂、霉菌毒素和其他低分子量化合物的有效识别元件而受到越来越多的关注[14][15][16]。基于适配体的比色传感器具有视觉识别、操作简单以及在紫外-可见光谱范围内可定量等优点[17]。目前的研究热点是将这些适配体与具有过氧化物酶活性的纳米酶结合，以提高检测性能[18][19]。适配体是比色传感器的核心识别元件，筛选技术是其开发的关键。常用的SELEX技术包括亲和柱SELEX[16]、磁珠SELEX[20]、毛细管电泳SELEX[21]、GO-SELEX[22]、捕获SELEX[23]、细胞SELEX[24]和核酸酶辅助SELEX[25]。由于GO具有优异的吸附性能，因此在适配体筛选中得到广泛应用。基于GO的SELEX技术不需要复杂的靶标固定步骤，避免了固定过程中可能导致的靶标结构变化，从而简化了筛选过程并显著提高了筛选效率[26]。我们的团队已使用GO-SELEX、磁珠辅助SELEX和磁交联沉淀SELEX成功生成了几种针对抗生素的适配体[27][28]。与其他技术相比，GO-SELEX过程更稳定、简单、经济高效且能更有效地获得目标特异性适配体。据现有文献报道，尚未有关于使用GO-SELEX筛选NOR并制备NOR分析适配体的研究。

在本研究中，使用GO-SELEX技术筛选了结合NOR的适配体，并设计了一种用于选择性检测NOR的比色适配体。评估了NOR适配体的结合亲和力（Kd）和选择性，并通过分子动力学（MD）模拟和分子对接研究了复合物的相互作用位点和构象特性。结果进一步验证了GO-SELEX技术的高筛选效率。随后，基于Fe₃O₄纳米酶的比色适配体传感平台进行了优化，并使用选定的抗NOR适配体在动物源性食品中检测NOR，其性能与HPLC进行了比较。

材料与试剂

诺氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFL）、恩诺沙星（ENR）、环丙沙星（CIP）、培氟沙星（PEF）、硝呋唑酮（NFZ）、氯霉素（CAP）、四环素（TET）、磺胺二甲嘧啶（SDZ）等参考抗生素由Aladdin Biotechnology Inc.（中国上海）提供。GO来自南京XFNANO Materials Tech Co. Ltd。所有其他试剂，包括DIPEA、Tris-HCl、MgCl₂和KH₂PO₄，由Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）提供。链霉亲和素磁珠也由该公司提供。

NOR适配体的筛选

在GO-SELEX中，初始文库包含大量随机单链DNA（ssDNA），首先与目标NOR孵育。加入GO后，未与目标结合的ssDNA被GO吸附并通过离心去除，而与NOR紧密结合的ssDNA则留在上清液中。GO-SELEX筛选的效率归因于GO的优异吸附性能和显著的光学特性，以及适配体在溶液中与目标的强选择性结合。

结论

总结来说，通过GO-SELEX筛选成功鉴定出一种特异性针对NOR的适配体（Seq27-1，碱基序列：5'-GTCCGGTGCGGGGGCAAGCGGAT-3'），并随后开发了一种用于NOR检测的比色适配体。在优化条件下，该适配体的检测限（LOD）低至1.04 ng/mL，其性能优于或可与之前报道的方法（如毛细管电泳、酶联免疫吸附测定和高效液相色谱[44][45][46][47]）相媲美。

CRediT作者贡献声明

乐涛：撰写、审稿与编辑、监督、资金筹集。谢勇：软件开发、项目管理、资金筹集。雷贤璐：方法学研究、数据分析。孙琦：数据可视化、概念构思。姜双：软件开发、数据分析。周朝阳：初稿撰写、验证。王雪：初稿撰写、验证、方法学研究

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了重庆市教育委员会科学技术研究计划（资助编号：KJZD-M202400501）和重庆市教育委员会研究生科学研究与创新项目（编号：CYB25244）的支持。