来自精浆细胞外囊泡的miR-296-3p通过下调溶血磷脂酰胆碱（Lys phosphatidylcholine）的水平，作用于PLA2G6蛋白，从而增强公猪精子的运动能力

《Animal Reproduction Science》：Seminal Plasma Extracellular Vesicle–derived miR-296-3p Targets PLA2G6 to Enhance Boar Sperm Motility by Lowering Lys phosphatidylcholine.

本研究通过分离猪精子外泌体（SPEVs）并分析其在17℃液态保存中的作用，发现携带miR-296-3p的SPEVs可靶向抑制PLA2G6，减少神经酰胺磷脂（LPC）生成，从而降低氧化应激和凋亡水平，显著提高精子活力。

　　

Kun Zhao|Yang An|Yuyang Zhang|Junzheng Zhang|Hao Li|Jie Wang|Zhiwei Yao|Tan Wang|Liang Chen|Xuan Chen|Yi Jin

中国吉林省延吉市延边大学农业学院动物科学系，邮编133002

摘要

精液血浆中含有丰富的细胞外囊泡（EVs）；然而，EV与精子相互作用的机制仍不清楚。本研究探讨了精液血浆细胞外囊泡（SPEVs）所携带的miR-296-3p在公猪精子功能中的调节作用。通过转录组学和代谢组学分析（RNA-seq和LC-MS/MS），研究了在17°C下液体储存第4天时，两组精子（0-SPEVs和8-SPEVs）的miRNA表达谱和代谢特征。共鉴定出50个差异表达的miRNAs和24个差异表达的代谢物。在17°C储存条件下，8-SPEVs组的精子活力显著高于0-SPEVs组（P < 0.01）。进一步研究表明，miR-296-3p从SPEVs转移到精子中，并靶向PLA2G6，从而减少了溶血磷脂酰胆碱（LPC）的产生并降低了氧化应激水平。这体现在丙二醛（MDA）和ROS水平的显著下降（P < 0.01），以及17°C液体储存期间线粒体膜电位（ΔΨm）去极化的缓解。RT-qPCR和Western blot分析证实，miR-296-3p的过表达显著降低了与凋亡相关信号的标志物（P < 0.01）。总之，SPEV来源的miR-296-3p通过靶向PLA2G6来调节甘油磷脂代谢，减少LPC水平，从而减轻氧化应激和类似凋亡的变化，最终提高了17°C液体储存期间的精子活力。本研究为17°C精子储存过程中SPEV介导的调节提供了新的机制见解，并为提高公猪精液保存质量提供了潜在的应用前景。

引言

公猪的繁殖能力是遗传育种的核心指标，精子活力是一个与繁殖性能密切相关的关键参数（Gòdia等人，2020年）。精液血浆是精液的液体成分，富含由前列腺、附睾和附属腺分泌的蛋白质、微小RNA（miRNAs）和其他生物活性因子，其动态组成直接调节精子微环境的稳态（Garcia等人，2010年；Mills等人，2020年）。在哺乳动物中，从睾丸释放的精子通过附睾和附属生殖器官运输，在此过程中经历适应性形态和功能重塑，最终具备完全的受精能力。具体来说，男性生殖道的分泌物调节精子膜的脂质和蛋白质组成（Di Nisio等人，2023年）。精液血浆在精子代谢、功能维持、存活和运输中起着不可或缺的作用（Druart，de Graaf等人，2018年），表明精液血浆与精子之间存在密切的相互作用和物质交换。 SPEVs因其独特的分子组成而成为研究的重点。在哺乳动物中，SPEVs是直径约为50–500纳米的膜囊泡，主要由前列腺和附睾分泌。这些囊泡具有复杂的分子组成，包括蛋白质以及较高水平的鞘脂和胆固醇（Zhang等人，2020年）。先前的研究表明，SPEVs在体外与精子结合，从而增强精子活力、改善膜完整性、提高抗氧化能力和延长存活时间（Du等人，2016年）。这些观察结果表明，SPEVs在液体储存过程中对维持精子功能起着关键作用。此外，其他研究还表明，SPEVs通过结合精子膜并将蛋白质（如AWN和PSP-1）转移到精子中来保护精子功能（Du等人，2016年）。 此外，研究表明，在多种体液中检测到的EVs将RNA货物传递给目标细胞，介导细胞间通讯，参与凋亡、增殖和分化、免疫调节和信号转导等过程（Sun等人，2021年；Wang等人，2025年）。作为重要的载体，SPEVs含有多种货物，包括蛋白质、脂质、DNA和RNA。值得注意的是，SPEVs通过miRNAs调节精子功能，从而提高精液质量并增强公猪的繁殖效率（Sun等人，2021年；Zhao等人，2024年；Zhang等人，2024年）。尽管研究表明EVs可以在17°C下液体储存期间调节公猪精子的功能，但具体的分子机制仍不清楚。 miRNAs是长度为18–25个核苷酸的内源性非编码单链RNA。它们通过结合目标mRNAs的3′非翻译区（3′ UTR）的种子区域来调节蛋白质编码基因的表达，从而参与分化、代谢和凋亡等关键过程（Saliminejad等人，2019年）。在生殖生物学中，miRNAs在生殖系统的发育和功能维持、配子发生和成熟、受精以及早期胚胎发育中起着至关重要的作用。例如，由精液EVs释放的miR-222通过靶向BCL2L11来抑制精子凋亡，从而维持精子活力（Ding等人，2021年）。此外，miR-21-5p通过靶向vinculin（VCL）mRNA并抑制其翻译来延缓精子获能，同时在液体储存期间保持顶体完整性（Xie等人，2022年）。 miR-296-3p是一种高度保守的X连锁miRNA，在癌症、血管生成和干细胞维持等过程中起着关键的调节作用（Bai等人，2013年；Li等人，2021年）。研究表明，高生育力和低生育力公猪的精子中miR-296-3p的表达存在显著差异，这种差异与受孕率相关（Mu?oz等人，2015年）。最近的生物信息学分析进一步表明，miR-296-3p在调节精子活力中起着关键作用（Abu-Halima等人，2014年）。此外，多项研究报告称miR-296-3p与早期凋亡事件有关，并显著影响精子活力（Abhari等人，2014年；Aravat等人，2024年）。 先前的研究表明，SPEVs在维持精子活力和存活能力、保持膜完整性、增强抗氧化能力和抑制过早获能方面起着关键作用（Du等人，2016年）。然而，对SPEVs的转录组学和代谢组学研究仍然有限。因此，在本研究中，使用高通量RNA测序（RNA-seq）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术来分析在两种SPEV条件下（0-SPEVs和8-SPEVs）液体储存第4天时精子的miRNA表达。还比较了这两种条件下精子的代谢变化。鉴于先前研究表明miR-296-3p与精子生育力和活力相关（Abhari等人，2014年；Abu-Halima等人，2014年；Mu?oz等人，2015年；Aravat等人，2024年），为了阐明SPEVs在17°C液体储存期间如何调节公猪精子功能，我们实施了一个两阶段的工作流程，包括SPEV分离/表征、精子储存模型、多组学筛选和机制验证。从健康的公猪中收集精液，每次射精作为独立的生物重复样本进行处理，不进行混合。通过差速超离心从精液血浆中分离SPEVs并进行表征。 在第一阶段，将同一射精中的精子分成平行组，在17°C下无菌储存7天，分别添加0-SPEVs或8-SPEVs（浓度为800 μg/mL）。每天记录精子活力参数，并对第4天的样本进行小RNA测序和无靶标LC–MS/MS代谢组学分析。使用综合生物信息学分析来优先确定候选的miRNA-靶基因-代谢途径轴。 在第二阶段，对优先确定的轴进行因果关系测试。通过电穿孔将miR-296-3p模拟物或阴性对照寡核苷酸加载到SPEVs中，并通过100-kDa超滤去除游离寡核苷酸以生成EV-miRNA制剂。EV-miRNAs与精子共培养并在相同条件下储存；每天监测精子活力，并在第2天和第4天收集样本进行分子和功能验证，包括RT–qPCR（加载效率/表达）、Western blotting和双荧光素酶测定（靶向）、LPC定量以及氧化应激、线粒体功能和类似凋亡变化的评估。统计显著性设定为P < 0.05。本研究为miRNAs在公猪精液中的功能提供了新的机制见解，并为17°C精子储存过程中的SPEV介导的代谢重编程提供了重要视角。

精液收集

在中国吉林省延吉市延边正兴公猪繁殖站，使用计算机辅助精子分析（CASA）系统（IVOS II；法国）对20头健康的、具有繁殖能力的兰德拉斯品种公猪（14–22个月大）的精液质量进行了评估（补充表1）。其中8头公猪符合入选标准，构成了供体池（总精子活力≥80%，正常形态≥85%，精子浓度≥1 × 10?精子/mL）。除非另有说明，这些公猪的射精样本均被单独使用。

SPEVs的分离和表征

通过超离心从公猪精液中分离出SPEVs。透射电子显微镜（TEM）显示，分离出的SPEVs具有完整的形态，特征是典型的双层膜结构（图1A）。进一步使用NTA技术表征SPEVs的粒径分布，结果显示平均直径为109.4纳米，大多数粒子的大小在50至200纳米之间（图1B），这与EVs的典型大小范围一致。此外，Western blot分析显示这些囊泡含有外泌体标志蛋白。

讨论

到目前为止，关于在不同浓度下与SPEVs孵育的精子的转录组学和代谢组学特征了解甚少。本研究主要探讨了miR-296-3p在猪SPEVs中对精子功能的调节机制。通过综合转录组学和代谢组学分析以及靶向分子验证，我们阐明了17°C液体储存期间公猪精子中的一个调节轴，即miR-296-3p通过抑制PLA2G6来调节精子功能。

结论

研究表明，SPEVs传递的miR-296-3p通过靶向和抑制PLA2G6来增强精子活力，从而减少LPC的产生并减轻氧化应激和类似凋亡的变化。这项研究为精子功能的调节提供了新的分子视角，并对畜牧业育种和雄性生殖健康具有重要意义。

资助

本研究得到了吉林省自然科学基金（222621JC0103102748）的支持。

CRediT作者贡献声明

Jie Wang：验证、软件、方法学。 Hao Li：验证、调查、正式分析。 Tan Wang：可视化、验证、软件。 Zhiwei Yao：验证、软件、调查。 Xuan Chen：可视化、资源、方法学、正式分析、数据管理、概念化。 Liang Chen：可视化、验证、软件。 Yi Jin：验证、监督、资源、项目管理、资金获取、正式分析、概念化。 Kun Zhao：写作——审稿。

利益冲突声明

所有作者均无需要声明的利益冲突。

致谢

作者们衷心感谢Jin Yi博士和Chen Xuan博士；感谢延边大学农业学院动物科学系提供的技术平台和实验条件；同时感谢延吉市育种猪场提供的实验样本。